Pagrindinis skirtumas – šilta ir š alta tripsinizacija
Šiltas ir š altas tripsinizavimas yra du metodai, naudojami fermentiniam ląstelių skaidymui gyvūnų ląstelių kultivavimo metu. Pagrindinis skirtumas tarp šilto ir š alto tripsinizacijos, kaip rodo pavadinimai, priklauso nuo temperatūros, kurioje tripsinas pridedamas ląstelėms suskaidyti. Šilta tripsinizacija vyksta aukštesnės temperatūros sąlygomis (36,5–37 0C), o š alta tripsinizacija vyksta žemos temperatūros sąlygomis.
Gyvūnų ląstelių pirminio kultivavimo procese naudojami trys pagrindiniai metodai, kurie pasiteisino. Trys metodai apima mechaninį ląstelių skaidymą, fermentinį ląstelių skaidymą ir pirminę eksplanto techniką. Ląstelių fermentinis skaidymas, dėl kurio ląstelės išskiriamos, atlieka b altymus skaidantis fermentas tripsinas. Todėl šis procesas žinomas kaip tripsinizacija. Tripsinizacija gali būti atliekama dviem skirtingomis sąlygomis, būtent šiltuoju ir š altuoju tripsinizavimu. Šiltas tripsinizavimas – tai ląstelių apdorojimas tripsinu šiltomis sąlygomis 36,5–37 0C temperatūroje. Š altasis tripsinizavimas yra apdorojimo tripsinu procesas, kuris vyksta š altesnėmis sąlygomis, pageidautina, esant ledui, išlaikant labai žemą temperatūrą.
Kas yra šilta tripsinizacija?
Galima atlikti tripsinizaciją, siekiant išskaidyti ląstelinius komponentus, kad būtų galima išskirti ląsteles, kad susidarytų pirminė ląstelių kultūra. Tripsinas yra b altymų skaidymo fermentas, o fermentų mišinys, naudojamas tripsinizacijai, gali būti neapdorotas ekstraktas arba išgrynintas produktas. Teigiama, kad neapdorotas ekstraktas efektyviau skaido b altymus ir skaido ląsteles, nes jame yra kitų skaidančių fermentų.
Šiltoji tripsinizacija yra dažniausiai naudojamas fermentinis ląstelių skaidymo metodas, vykstantis aukštesnės temperatūros sąlygomis. Prieš apdorojimą tripsinizacija norimas audinys susmulkinamas į mažesnius gabalėlius. Tai palengvina lengvą skaidymo procesą. Tada susmulkintas audinys nuplaunamas specialioje terpėje, vadinamoje Dissection Basal S alt terpe.
Pabaigus plovimo etapą, ląstelės transformuojamos į kolbą, kurioje yra aktyvus fermentas – tripsinas. Kadangi šis metodas reiškia šiltą tripsinizacijos protokolą, tripsinas maždaug keturioms valandoms laikomas maždaug 37 0C temperatūroje.
01 pav.: tripsinas
Turinys sumaišomas ir maišomas naudojant centrifugavimo metodus, kad būtų lengviau vykdyti protokolą ir pagreitinti skaidymo procesą. Pasiekus rekomenduojamą laiką, ląstelės gali būti išvestos iš supernatanto. Tada ląstelės, gautos iš supernatanto, inkubuojamos tam tikroje temperatūroje ir tam tikru laiku.
Kas yra š altoji tripsinizacija?
Š altasis tripsinizavimas yra kitas tripsinizacijos tipas, vykstantis š altomis sąlygomis. Taikant šią techniką, susmulkintos ir nuplaunamos ląstelės dedamos į buteliukus ant ledo ir mirkomos tripsinu. Mirkymo laikotarpis gerokai ilgesnis – apie 6 – 24 val.
Pabaigus mirkymo procedūrą, tripsinas pašalinamas iš ląstelių lizato, o audinių gabalėliai toliau inkubuojami 37 0C temperatūroje apie 20–30 minučių. Ląstelių išskaidymas vyksta pakartotinai pipetuojant audinių mišinį. Tai leis ląstelėms atsiskirti nuo membranos ir patekti į supernatantą. Kai ląstelės yra supernatante, jos inkubuojamos ir auginamos norimoje temperatūroje ir laikotarpyje.
Š altasis tripsinizacijos metodas turi keletą privalumų
- Didesnis gyvybingų ląstelių derlius, nes sumažinamas ląstelių pažeidimas. Ląstelių pažeidimas sumažinamas nenaudojant centrifugavimo etapų.
- Labai patogus būdas.
- Mažiau darbo.
Pagrindinis š altojo tripsinizacijos metodo apribojimas yra tas, kad vienu atveju negalima naudoti didelių kiekių.
Kokie yra šilto ir š alto tripsinizacijos panašumai?
- Tiek šilto, tiek š alto tripsinizacijos procesuose ląstelėms skaidyti naudojamas fermentas tripsinas.
- Tiek šilto, tiek š alto tripsinizacijos procesai naudojami ląstelių kultūros procedūrose ląstelėms skaidyti.
- Tiek šilto, tiek š alto tripsinizacijos procedūrų metu ląstelės gaunamos iš supernatanto.
Kuo skiriasi šilta ir š alta tripsinizacija?
Šilto prieš š altą tripsinizaciją |
|
| Šilta tripsinizacija – tai ląstelių apdorojimo tripsinu metodas šiltomis sąlygomis 36,5–37 °C temperatūroje 0. | Š alta tripsinizacija – tai apdorojimo tripsinu procesas, kuris vyksta š altesnėmis sąlygomis, pageidautina, esant ledui, išlaikant labai žemą temperatūrą. |
| Protokolas | |
| Susmulkinti audinio gabalėliai nuolat palaikomi 37 0C temperatūroje. | Supjaustyti audinio gabalėliai iš pradžių palaikomi ledo temperatūroje, o vėliau palaikomi 37 °C 0. |
| Temperatūra | |
| Šilta tripsinizacija vyksta esant 36,5–37 0 | Š alta tripsinizacija vyksta esant š altai ledo temperatūrai. |
| Sunaudotas laikas | |
| Visam šilto tripsinizacijos procesui reikia mažiau laiko (apie 4 valandas). | Reikia ilgesnio laiko (apie 6–24 val.) š altai tripsinizacijai. |
| Gyvybingų ląstelių išeiga | |
| Mažai šilto tripsinizacijos. | Didelis š alto tripsino kiekio. |
| Centrifugavimo naudojimas | |
| Centrifugavimas reikalingas ląstelėms išskaidyti atliekant šiltą tripsinizaciją. | Atliekant š altą tripsinizaciją centrifuguoti nereikia. |
| Pradinis audinių kiekis tripsinizacijai | |
| Didesnis audinio kiekis gali būti naudojamas šiltai tripsinizacijai. | Mažesnis audinio kiekis gali būti naudojamas š altai tripsinizacijai. |
| Ląstelės pažeidimas | |
| Didelis dėl centrifugavimo šiltu tripsinizavimu. | Mažiau dėl š alto tripsinizacijos. |
Santrauka – šilta ir š alta tripsinizacija
Tripsinizacija yra b altymus skaidančio fermento tripsino naudojimo būdas pirminėms ląstelių kultūroms skaidyti ir paruošti ląstelių kultivavimo proceso metu. Yra du pagrindiniai tripsinizacijos būdai, pagrįsti procedūros metu naudojama temperatūra. Jie yra šilta ir š alta tripsinizacija. Šilta tripsinizacija atliekama 37 0C temperatūroje, o š alta tripsinizacija atliekama š altomis ledo sąlygomis. Nors š alta tripsinizacija užtrunka ilgiau, teigiama, kad ji turi didesnį gyvybingų ląstelių kiekį. Taip yra dėl to, kad naudojant š altą tripsinizaciją ląstelių pažeidimas yra minimalus, nes nenaudojami energingi centrifugavimo etapai. Tai yra skirtumas tarp šilto ir š alto tripsinizacijos.
