Pagrindinis skirtumas tarp įprastų įdėtųjų ir realaus laiko PGR tyrimų yra tas, kad įprastas PGR yra metodas, sukurtas specifinėms DNR sekoms amplifikuoti, o įdėtoji PGR yra įprastinės PGR modifikacija, kurią sudaro dvi nuoseklios amplifikacijos reakcijos, o tikroji -time PGR yra įprastinės PGR variantas, galintis kiekybiškai įvertinti amplifikuotą produktą.
PGR yra labai paplitęs mokslinis metodas, plačiai naudojamas tyrimuose ir medicinoje DNR aptikti. PGR testai naudojami antigenams aptikti, nustatant jų DNR arba RNR. Paprastai viruso RNR yra organizme prieš aptinkant antikūnus arba pasireiškiant ligos simptomams. PGR testas gali nustatyti, ar kažkas anksti užsikrėtė virusu, ar ne. Šiuo metu PGR yra standartinis COVID-19 ligos nustatymo testas. Yra įvairių tipų PGR metodų, tokių kaip realaus laiko PGR, įdėtoji PGR, multipleksinė PGR, karštojo paleidimo PGR ir ilgojo nuotolio PGR ir kt.
Kas yra įprasti PGR tyrimai?
Įprastas PGR tyrimas yra in vitro DNR amplifikacijos technika, įprastai atliekama molekulinės biologijos laboratorijose. Šis metodas leido pagaminti nuo tūkstančių iki milijonų konkretaus DNR fragmento kopijų. Kary Mullis pristatė šią techniką 1980 m. Tam, kad būtų galima padaryti daug jo kopijų, reikalingas DNR fragmentas, žinomas kaip šablonas. Taq polimerazė veikia kaip DNR polimerazės fermentas ir katalizuoja naujų šablono sekos grandžių sintezę.
PGR mišinio pradmenys veiks kaip fragmentų išplėtimo pradžios taškai. Į PGR mišinį įtrauktos visos sudedamosios dalys, reikalingos DNR kopijoms padaryti. PGR reakcija vykdoma PGR aparate ir turi būti maitinamas tinkamu PGR mišiniu ir tinkama PGR programa. Jei reakcijos mišinys ir programa yra teisingi, jis sukurs reikiamą tam tikros DNR dalies kopijų skaičių iš labai mažo DNR kiekio.
01 pav.: Įprastas PGR tyrimas
Yra trys pagrindiniai PGR reakcijos etapai: denatūravimas, pradmenų atkaitinimas ir grandinės pratęsimas. Šie trys etapai vyksta trimis skirtingomis temperatūromis. PGR buferis palaiko optimalias Taq polimerazės veikimo sąlygas. Šie trys PGR reakcijos etapai kartojami, kad būtų gautas reikiamas PGR produkto kiekis. Kiekvienos PGR reakcijos metu DNR kopijų skaičius padvigubėja. Taigi PGR galima stebėti eksponentinį amplifikaciją. PGR produktą galima išskirti naudojant gelio elektroforezę, nes jis sukuria matomą DNR kiekį ant gelio ir gali būti išgrynintas tolesniems tyrimams, pvz., sekos nustatymui.
PGR yra vertinga medicinos ir biologinių tyrimų priemonė. Ypač teismo medicinos tyrimuose PGR turi didžiulę vertę, nes jis gali sustiprinti DNR tyrimams iš mažyčių nusik altėlių mėginių ir sudaryti teismo DNR profilius. PGR plačiai naudojamas daugelyje molekulinės biologijos sričių, įskaitant genotipų nustatymą, genų klonavimą, mutacijų nustatymą, DNR sekos nustatymą, DNR mikromatricas ir tėvystės tyrimus.
Kas yra įdėtos PGR tyrimai?
Nested PGR yra PGR tipas, kuris sumažina nespecifinę DNR amplifikaciją. Įdėtajame PGR tyrime yra du iš eilės PGR arba dvi nuoseklios amplifikacijos reakcijos. Pirmosios amplifikacijos reakcijos metu susidaro PGR produktas. Po pirmosios reakcijos atliekama antroji amplifikacijos reakcija su pirmosios reakcijos PGR produktu. Todėl antrojo reakcijos mišinio pradmenys jungiasi su pirmuoju PGR produktu ir jį amplifikuoja.
02 pav.: Įdėtasis PCR
Kiekvienoje reakcijoje pradmenų poros skiriasi. Nespecifinis pradmenų surišimas sumažinamas naudojant įdėtą PGR. Įdėtos PGR tyrimai yra naudingi jautrumui ir (arba) specifiškumui padidinti. Tačiau įdėtoji PGR reikalauja žinių apie dominančią seką.
Kas yra realaus laiko PGR tyrimai?
Realiojo laiko PGR arba kiekybinė PGR (Q PGR) yra modifikuota PGR versija, kuri kiekybiškai matuoja PGR produktus. Todėl šis metodas kiekybiškai įvertina amplifikaciją realiuoju laiku, naudojant realaus laiko PGR aparatą. Tai taip pat tinkamas metodas tikslinės sekos ar geno kiekiui mėginyje nustatyti.
Įdomi realaus laiko PGR ypatybė yra ta, kad ji sujungia tiek amplifikaciją, tiek tikrąjį kiekybinį nustatymą į vieną veiksmą. Todėl aptikimo gelio elektroforezės poreikį galima pašalinti naudojant realaus laiko PGR metodą. Naudojant fluorescencinius dažus PGR produktams žymėti PGR reakcijų metu, galiausiai bus atliktas tiesioginis kiekybinis įvertinimas. Kai kaupiami PGR produktai, kaupiami ir fluorescenciniai signalai, kuriuos matuoja realaus laiko aparatas. SYBR Green ir Taqman yra du būdai aptikti arba stebėti realaus laiko PGR stiprinimo procesą. Abu metodai stebi stiprinimo proceso eigą ir praneša apie produkto kiekį realiuoju laiku.
03 paveikslas: PGR realiuoju laiku
Realiojo laiko PGR pritaikymas labai įvairus, pavyzdžiui, genų ekspresijos kiekybinis nustatymas, mikroRNR ir nekoduojančios RNR analizė, SNP genotipų nustatymas, kopijų skaičiaus variantų nustatymas, retų mutacijų aptikimas, genetiškai modifikuotų organizmų aptikimas ir infekcijos sukėlėjų aptikimas.
Kokie yra įprastinių įdėtųjų ir realaus laiko PGR tyrimų panašumai?
- Įdėtos ir realaus laiko PGR tyrimai yra įprastinio PGR tyrimo modifikacijos.
- Visi trys metodai amplifikuoja DNR mėginius.
- Jų produktai gali būti naudojami nustatant seką arba analizuojant.
- Šiiems tyrimams reikalingi pradmenys.
Kuo skiriasi įprastiniai įdėtieji ir realaus laiko PGR tyrimai?
Įprastinė PGR yra metodas, sukurtas specifinėms DNR sekoms amplifikuoti. Tuo tarpu Nested PGR yra įprasto PGR modifikacija, kurią sudaro dvi nuoseklios amplifikacijos reakcijos, o realaus laiko PGR yra įprastinės PGR variantas, galintis kiekybiškai įvertinti amplifikuotą produktą. Taigi, tai yra pagrindinis skirtumas tarp įprastų įdėtųjų ir realaus laiko PGR tyrimų. Skirtingai nuo įprastinio ir realaus laiko PGR, įdėtoji PGR naudoja du pradmenų rinkinius. Be to, įdėtoje PGR yra dvi nuoseklios amplifikacijos reakcijos, siekiant sumažinti nespecifinę amplifikaciją. be to, įprastiniai ir realaus laiko PGR tyrimai neapima dviejų nuoseklių amplifikacijos reakcijų.
Toliau pateiktoje infografikoje pateikiami skirtumai tarp įprastų įdėtųjų ir realaus laiko PGR tyrimų lentelės pavidalu, kad būtų galima palyginti.
Santrauka – įprastiniai, įdėtieji ir realaus laiko PGR tyrimai
Įprastinė PGR yra pirmasis metodas, sukurtas specifiniams DNR fragmentams amplifikuoti. Įdėtasis PGR ir realaus laiko PGR yra du įprastinės PGR variantai. Yra dvi nuoseklios amplifikacijos reakcijos ir dviejų pradmenų rinkinių naudojimas įdėtoje PGR. Realaus laiko PGR sukurta siekiant kiekybiškai įvertinti amplifikuotą PGR produktą. Taigi, tai apibendrina skirtumą tarp įprastų įdėtųjų ir realaus laiko PGR tyrimų.
