Pagrindinis skirtumas tarp Golden Gate ir Gibson Assembly yra tas, kad Golden Gate priklauso nuo restrikcijos vietų buvimo konkrečioje sekoje, kurią reikia klonuoti, o Gibson Assembly nesiremia restrikcijos vietų buvimu konkrečioje sekoje. būti klonuoti.
Per pastaruosius dešimtmečius molekuliniai mokslininkai sukūrė įvairias standartizuotas procedūras, kurios leidžia lengviau surinkti kelis DNR fragmentus į vieną gabalą. Todėl tokius klonavimo metodus kaip Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly ir TOPO Cloning mokslininkai plačiai naudoja moksliniuose eksperimentuose. Todėl Golden Gate ir Gibson Assembly yra du molekulinio klonavimo metodai, leidžiantys sujungti kelis DNR fragmentus į vieną gabalą.
Kas yra Golden Gate Assembly?
Golden Gate yra molekulinio klonavimo metodas, palengvinantis kelių DNR fragmentų surinkimą į vieną gabalą. Šis metodas priklauso nuo restrikcijos vietų buvimo konkrečioje sekoje, kurią reikia klonuoti. Jis atsirado 1996 m. Šiam metodui naudojami IIS tipo restrikcijos fermentai ir T4 DNR ligazė. Šie fermentai supjausto DNR už atpažinimo vietų. Jie gali sukurti nepalindromines iškyšas. Todėl kelis DNR fragmentus galima surinkti naudojant iškyšulių sekų derinius.
01 pav.: Auksiniai vartai
Auksinių vartų surinkimo procedūra
Auksinių vartų techniką sudaro trys pagrindiniai procedūros etapai:
- klonavimo vektoriaus iškyšų kūrimas,
- kelių DNR intarpų surinkimas naudojant fragmentams būdingas sekas iškyšose ir
- rišimas.
Golden Gate surinkimas naudoja žiedinius klonavimo vektorius (paskirties vektorius). Be to, taikant šį metodą, restrikcijos vieta pašalinama iš perrišto produkto, kad būtų galima atlikti virškinimą ir surišimą vienu metu. Įprastas „Golden Gate“terminio ciklo protokolas svyruoja nuo 37 °C iki 16 °C, nes 37 °C yra optimalus restrikcijos fermentams, o 16 °C – ligazėms.
Kas yra Gibson Assembly?
Gibson Assembly yra molekulinio klonavimo metodas, leidžiantis sujungti kelis DNR fragmentus į vieną gabalą. Skirtingai nuo Golden Gate metodo, šis metodas nesiremia restrikcijos vietų buvimu konkrečioje klonuojamoje sekoje. Jį rado Danielis G. Gibsonas iš J. Craig Venter instituto. Šis metodas yra nuo sekos ir ligazės nepriklausomo klonavimo (SLIC) metodas.
02 pav.: Gibsono surinkimas
Gibsono surinkimo procedūra
Gibson Assembly reikia DNR fragmentų, turinčių 20–40 bazinių porų, persidengiančių su gretimais DNR fragmentais. Persidengimai pridedami naudojant PGR. Tada šie DNR fragmentai pridedami prie Gibsono maserio mišinio, kuriame yra trys fermentai. Ši procedūra atliekama izoterminėmis sąlygomis (50 °C temperatūroje 1 valandą), naudojant tris skirtingus fermentus: egzonukleazę, DNR polimerazę ir DNR ligazę. Egzonukleazė kramto DNR nuo 5’ galo. Taigi jis neslopina polimerazės aktyvumo ir neleidžia reakcijai vykti vienu procesu. Susidariusios vienos grandinės sritys gretimuose DNR fragmentuose gali būti sujungtos dėl sutapimo sekų. DNR polimerazė užpildo spragas pridedant nukleotidų. Galiausiai DNR ligazė kovalentiškai prisijungia prie gretimų segmentų DNR. Paprastai Gibson Assembly naudoja tiesinius paskirties vektorius. Be to, šiuo metodu vienu metu galima sujungti iki 15 DNR fragmentų, remiantis sekos panašumu.
Golden Gate ir Gibson Assembly panašumai
- Golden Gate ir Gibson Assembly yra du molekulinio klonavimo metodai.
- Abu metodai gali sujungti kelis DNR fragmentus į vieną gabalą.
- Šie metodai naudoja paskirties vektorius.
- Abu metodai naudoja terminius ciklerius, kad surinktų kelis DNR fragmentus.
- Jie naudojami vietinei mutagenezei.
Skirtumas tarp Golden Gate ir Gibson Assembly
Golden Gate yra molekulinio klonavimo metodas, naudojamas kelių DNR fragmentų surinkimui į vieną gabalą, pagrįstas restrikcijos vietų buvimu konkrečioje klonuotinoje sekoje, o Gibsono surinkimas yra molekulinio klonavimo metodas, naudojamas kelių DNR fragmentų surinkimas į vieną gabalą, nepasikliaujant restrikcijos vietų buvimu konkrečioje klonuotinoje sekoje. Tai yra pagrindinis skirtumas tarp Golden Gate ir Gibson Assembly. Be to, Golden Gate metodas naudoja apskritą paskirties vektorių, o Gibson Assembly metodas naudoja tiesinį paskirties vektorių.
Toliau pateiktoje infografijoje pateikiamas skirtumas tarp Golden Gate ir Gibson Assembly.
Santrauka – Golden Gate vs Gibson asamblėja
Molekulinis klonavimas yra metodas, naudojamas rekombinantinėms DNR molekulėms surinkti ir nukreipti jų replikaciją organizmuose šeimininkuose. „Golden Gate“ir „Gibson Assembly“yra du molekulinio klonavimo metodai, leidžiantys surinkti kelis DNR fragmentus į vieną gabalą. „Golden Gate“metodas remiasi restrikcijos vietų buvimu tam tikroje klonuotinoje sekoje, o „Gibson Assembly“nesiremia restrikcijos vietų buvimu konkrečioje klonuotinoje sekoje. Taigi, tai yra pagrindinis skirtumas tarp Golden Gate ir Gibson Assembly.
