Pagrindinis skirtumas – RAPD vs RFLP
Genetiniai žymenys yra naudojami molekulinėje biologijoje, siekiant nustatyti genetinius individų ir rūšių skirtumus. Atsitiktinė amplifikuota polimorfinė DNR (RAPD) ir apribojimo fragmento ilgio polimorfizmas (RFLP) yra du svarbūs molekuliniai žymenys, reguliariai naudojami laboratorijose. RAPD atliekamas su trumpais ir savavališkais oligonukleotidų pradmenimis, ir jis pagrįstas atsitiktiniu daugelio vietovių amplifikavimu visoje organizmo šabloninėje DNR. RFLP atliekama su specifine restrikcijos endonukleaze ir yra pagrįsta gautų restrikcijos fragmentų polimorfizmu ir hibridizacija. Pagrindinis skirtumas tarp RAPL ir RFLP yra tas, kad RAPD yra PGR technikos tipas, atliekamas be išankstinių žinių apie seką, tuo tarpu RFLP nedalyvauja PGR ir reikalauja išankstinių žinių apie seką, kad būtų galima atlikti šią techniką.
Kas yra RAPD?
RAPD yra naudingas molekulinis žymeklis molekulinėje biologijoje. Tai greita ir paprasta technika. RAPD gali būti apibrėžiamas kaip metodas, dėl kurio susidaro polimorfinės DNR sekos dėl kelių tikslinės DNR šablono vietų atsitiktinės amplifikacijos. RAPD PGR amplifikacijai naudoja trumpus oligonukleotidinius pradmenis su savavališkomis sekomis. Pradmenys yra dirbtinai sintetinami be išankstinių žinių apie seką. Todėl tai laikoma lengva ir naudinga technika.
Toliau nurodyti pagrindiniai RAPD veiksmai.
- Tikslinės DNR ekstrahavimas
- Kelių tikslinės DNR vietų amplifikacija naudojant atsitiktinai parinktus pradmenis
- Amplifikuotų PGR produktų gelio elektroforezė
- Dažymas etidžio bromidu ir polimorfizmo nustatymas
Dėl pradmenų atkaitinimo pokyčių amplifikacijos metu susidaro skirtingi skirtingo ilgio fragmentai. Taigi, skirtingų asmenų ir rūšių gelių juostų raštai skiriasi. Taigi RAPD leidžia aptikti organizmų genetinę variaciją identifikuojant ir diferencijuojant.
RAPD taikomas atliekant įvairius molekulinės biologijos tyrimus, tokius kaip genetinių skirtumų tarp artimai susijusių rūšių nustatymas, genų kartografavimas, DNR pirštų atspaudų ėmimas, paveldimų ligų nustatymas ir kt.
01 pav.: RAPD
Kas yra RFLP?
Restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmas (RFLP) yra molekulinis žymeklis, naudojamas molekulinėje biologijoje homologinių DNR sekų genetiniams variacijoms identifikuoti. Tai pirmasis genetinis žymeklis, sukurtas DNR pirštų atspaudams. Visi organizmai gamina unikalius DNR profilius, kai juos riboja specifiniai restrikcijos fermentai. RFLP yra svarbi priemonė kuriant unikalius individų DNR profilius ir nustatant jų genetinę variaciją. Kai DNR mėginiai virškinami specifinėmis restrikcijos endonukleazėmis, gaunami skirtingi DNR profiliai, kurie yra unikalūs kiekvienam asmeniui. Todėl šio metodo esmė yra genetinės variacijos tarp organizmų aptikimas ribojant homologinę DNR specifiniais restrikcijos fermentais ir fragmentų ilgio polimorfizmo analizė gelio elektroforezės ir blotavimo būdu. Blotavimo modeliai yra unikalūs kiekvienam organizmui ir apibūdina specifinius genotipus.
Su RFLP susiję šie veiksmai.
- Pakankamo DNR kiekio išskyrimas iš mėginių
- DNR mėginių su specifinėmis restrikcijos endonukleazėmis suskaidymas į trumpą seką
- Gautos skirtingo ilgio fragmentų atskyrimas agarozės gelio elektroforeze.
- Gelio profilio perkėlimas į membraną Southern blotting būdu
- Membranos hibridizavimas su paženklintais zondais ir fragmento ilgio polimorfizmo analizė kiekviename profilyje
RFLP taikoma įvairiai, pvz., paveldimų ligų diagnostikai, genomo kartografavimui, nusik altimų atpažinimui atliekant teismo medicinos tyrimus, tėvystės tyrimui ir kt.
02 paveikslas: RFLP genotipų nustatymas
Kuo skiriasi RAPD ir RFLP?
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD yra molekulinis žymeklis, pagrįstas atsitiktiniais pradmenimis ir PGR. | RFLP yra molekulinis žymeklis, pagrįstas skirtingo ilgio restrikcijos fragmentų gamyba. |
| Reikalingas pavyzdys | |
| RAPD analizei pakanka mažų DNR mėginių. | RFLP analizei reikalingas didelis kiekis išskirto DNR mėginio. |
| Laikas | |
| RAPD yra greitas procesas. | RFLP yra daug laiko reikalaujantis procesas. |
| Grunto naudojimas | |
| Naudojami atsitiktiniai pradmenys ir tie patys pradmenys gali būti naudojami skirtingoms rūšims. | Rūšiai specifiniai zondai naudojami RFLP hibridizacijai. |
| Patikimumas | |
| Metodikos patikimumas yra mažesnis, palyginti su RFLP. | RFLP yra patikima technika. |
| Blotting | |
| RAPD apima Southern bloting. | Southern blotting yra vienas RFLP žingsnis. |
| Alelinės variacijos aptikimas | |
| RAPD negali aptikti alelinių variantų. | Alelinius variantus gali aptikti RFLP. |
| Reikia sekos žinių | |
| RAPD nereikalauja išankstinių žinių apie seką. | Projektuojant zondą reikalingos išankstinės sekos žinios. |
| PCR | |
| PGR yra susijęs su RAPD | PCR nesusijęs su RFLP. |
| Atkuriamumas | |
| RAPD atkuriamumas yra mažas | RFLP, palyginti su RAPD, pasižymi dideliu atkuriamumu. |
Santrauka – RAPD vs RFLP
RAPD ir RFLP yra svarbūs žymenys, naudojami molekulinėje biologijoje. Abu metodai gali aptikti genetinius organizmų skirtumus. RAPD atliekamas naudojant atsitiktinius pradmenis. RFLP atliekama naudojant specifinius restrikcijos fermentus. Abu metodai sukuria unikalius atskirų organizmų DNR profilius. RAPD atlieka palyginti nedaug žingsnių nei RFLP. Tačiau jis duoda mažiau patikimus ir atkuriamus rezultatus nei RFLP. Tai yra pagrindinis skirtumas tarp RAPD ir RFLP.
