Pagrindinis skirtumas – PGR ir DNR sekos nustatymas
PGR ir DNR sekos nustatymas yra du svarbūs molekulinės biologijos metodai. Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra procesas, kurio metu sukuriama daug DNR fragmento kopijų. DNR sekos nustatymas yra metodas, kurio metu nustatoma tiksli tam tikro DNR fragmento nukleotidų tvarka. Tai yra pagrindinis skirtumas tarp PGR ir DNR sekos nustatymo. PGR yra vienas iš pagrindinių DNR sekos nustatymo žingsnių.
Kas yra PGR?
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra DNR amplifikacijos metodas, naudojamas molekulinėje biologijoje. Jis sukuria nuo tūkstančių iki milijonų tam tikro DNR fragmento kopijų. Šį metodą 1983 m. sukūrė Kary Mullis. Taikant šį metodą, amplifikuotinas DNR fragmentas yra šablonas, o DNR polimerazės fermentas prideda komplementarių nukleotidų į pradmenį, kuris yra PGR mišinyje. Pasibaigus PGR reakcijai, susintetinama daug DNR mėginio kopijų.
Yra įvairių PGR mišinio komponentų, įskaitant DNR, DNR polimerazę (Taq polimerazę), pradmenis (pirminius ir atvirkštinius pradmenis), nukleotidus (DNR statybinius blokus) ir buferį. PGR vyksta PGR aparate, į įrenginį reikia įkelti tinkamą PGR mišinį ir paleisti tinkamą programą. Šis metodas leidžia pagaminti nuo tūkstančių iki milijonų tam tikros DNR dalies kopijų iš labai mažo DNR kiekio.
PGR reakcijos vyksta cikliškai, kad susidarytų matomas PGR produktų kiekis ant gelio. Yra trys pagrindiniai PGR reakcijos etapai, būtent denatūravimas, pradmenų atkaitinimas ir grandinės pratęsimas, kaip parodyta 01 paveiksle. Šie trys etapai vyksta trimis skirtingomis temperatūromis. DNR egzistuoja dvigrandės formos vandeniliniais ryšiais tarp komplementarių bazių. Prieš tai, dvigrandė DNR turi būti atskirta viena nuo kitos. Tai daroma suteikiant aukštą temperatūrą. Aukštoje temperatūroje dvigrandė DNR denatūruojasi į vieną grandinę. Tada pradmenys turėtų priartėti prie konkretaus fragmento arba DNR geno besiribojančių galų. Gruntas yra trumpas vienos grandinės DNR gabalas, kuris yra papildomas tikslinei sekai. Pirmieji ir atvirkštiniai pradmenys susilieja su komplementariomis bazėmis denatūruoto mėginio DNR šoniniuose galuose, esant atkaitinimo temperatūrai. Gruntai turi būti atsparūs karščiui. Kai pradmenys susilieja su mėginio DNR, taq polimerazės fermentas inicijuoja naujų grandinių sintezę, pridėdamas nukleotidų, kurie yra papildomi tikslinei DNR. Taq polimerazė yra karščiui stabilus fermentas, išskirtas iš termofilinės bakterijos, vadinamos Thermus aquaticus. PGR buferis palaiko optimalias sąlygas taq polimerazės veikimui. Šie trys PGR reakcijų etapai kartojami, kad susidarytų reikiamas PGR produkto kiekis. Po kiekvienos PGR reakcijos DNR kopijos skaičius padvigubinamas. Taigi PGR galima pastebėti eksponentinį amplifikaciją. PGR produktai gali būti stebimi naudojant gelio elektroforezę ir gali būti išgryninti tolesniems tyrimams.
01 pav.: pagrindiniai PGR reakcijos žingsniai
PGR yra vertinga medicinos ir biologinių tyrimų priemonė. PGR turi ypatingą vertę kriminalistikos moksle, nes jis gali sustiprinti DNR tyrimui iš mažyčių nusik altėlių mėginių ir sudaryti teismo ekspertizės DNR profilius. PGR plačiai naudojamas daugelyje molekulinės biologijos sričių, įskaitant genotipų nustatymą, genų klonavimą, mutacijų nustatymą, DNR sekos nustatymą, DNR mikromatricas ir tėvystės tyrimus ir kt.
02 pav.: polimerazės grandininė reakcija
Kas yra DNR sekos nustatymas?
DNR sekos nustatymas – tai tikslios nukleotidų – adenino, guanino, citozino ir timino – eilės nustatymas tam tikrame DNR fragmente. Genetinė informacija saugoma DNR sekose, naudojant teisingą nukleotidų tvarką. Taigi, norint sužinoti tikslią nukleotidų tvarką DNR fragmente, labai svarbu žinoti apie genų struktūrą ir funkcijas.
DNR sekos nustatymo protokolas apima skirtingus procesus. Pirmasis žingsnis yra suinteresuotos organizmo DNR arba genominės DNR išskyrimas. Naudojant PGR (kaip aprašyta aukščiau), norima DNR sritis turi būti amplifikuota. Amplifikuotas PGR produktas turi būti atskirtas gelio elektroforeze ir išgrynintas. Sustiprinti fragmentai naudojami kaip sekos nustatymo šablonai. Sekvenavimas gali būti atliekamas naudojant Sanger sekos arba didelio našumo sekos metodą. Norint nustatyti Sangerio seką, reikalinga gautų DNR fragmentų kapiliarinė elektroforezė. Nustatyti teisingą nukleotidų tvarką galima rankiniu būdu nuskaitant autoradiografus arba naudojant automatinius DNR sekvenavimo įrenginius.
Genų sekos nustatymas prisidėjo prie žmogaus genomo projekto ir palengvino žmogaus genomo kartografavimą 2003 m. Kriminalistikoje DNR sekos nustatymas leido identifikuoti asmenis, turinčius unikalias DNR sekas ir identifikuoti nusik altėlius. Medicinoje DNR sekos nustatymas gali būti naudojamas aptikti genus, atsakingus už genetines ir kitas ligas, surasti defektinius genus ir pakeisti juos tinkamais genais. Žemės ūkyje kai kurių mikroorganizmų DNR sekos nustatymo informacija naudojama transgeninėms kultūroms su ekonomiškai pageidaujamomis savybėmis auginti.
03 pav.: DNR sekos nustatymas
Kuo skiriasi PGR ir DNR sekos nustatymas?
PCR vs DNR sekos nustatymas |
|
| PGR procesas sukuria tūkstančius ar milijonus dominančio DNR fragmento kopijų. | DNR sekos nustatymas yra tikslios nukleotidų tvarkos tam tikrame DNR fragmente nustatymo procesas. |
| Rezultatas | |
| PGR sukuria tūkstančius ar milijonus konkretaus DNR fragmento kopijų | Tai lemia teisinga bazių tvarka tam tikrame DNR fragmente. |
| ddNTP dalyvavimas | |
| PGR nereikia ddNTP. Jis naudoja dNTP. | DNR sekos nustatymui reikalingi ddNTP, kad nutrauktų grandinės formavimąsi. |
Santrauka – PGR ir DNR sekos nustatymas
PGR ir DNR sekos nustatymas yra labai svarbios priemonės daugelyje molekulinės biologijos sričių. DNR fragmentų amplifikacija atliekama PGR metodu, o teisinga DNR fragmento nukleotidų tvarka nustatoma pagal DNR seką. Tai yra skirtumas tarp PGR ir DNR sekos nustatymo.
