Pagrindinis skirtumas tarp klonavimo pagal kloną ir šautuvų sekos nustatymo yra jų elgesio metodas. Klonavimas klonuojant sekos nustatymo metodą apima chromosomų kartografavimą ir klonavimą prieš sekos nustatymą, o atliekant klonavimą šautuvu, sekvenavimo metu praleidžiami ir chromosomų atvaizdavimo, ir klonavimo etapai.
Klonavimas klonų sekos nustatymu ir klonavimas šautuvu yra du šiuolaikinio genomo sekos nustatymo metodai. Klonavimas pagal klonų seką yra patikimesnis sekos nustatymo metodas. Tačiau klonavimo metodas šautuvų sekos nustatymo būdu yra greitesnis ir pigesnis. Straipsnyje dėmesys sutelkiamas į subtilų skirtumą tarp sekvenavimo klonuose ir šautuvų sekos.
Kas yra klonavimas pagal kloną?
Klonavimas klonų sekos nustatymu yra genomo sekos nustatymo metodas. Tam reikia nustatyti kiekvienos chromosomos kartografiją prieš DNR padalijimą. Po kartografavimo DNR turėtų būti suskaidyta į 150 kilobazių ilgio fragmentus. Tada šie fragmentai yra paruošti sekos nustatymui. Kitas žingsnis yra DNR fragmentų įterpimas į bakterines dirbtines chromosomas (BAC), o po to į bakterijų ląsteles. Kadangi fragmentai dabar yra bakterijų ląstelėse, kiekvieną kartą, kai bakterijos dalijasi, įterpti DNR fragmentai taip pat dalijasi ir sukuria daug identiškų kopijų. Tada atskira bakterijų klono DNR suskaidoma į 500 bazinių porų ilgio fragmentus. Jie yra mažesni ir persidengiantys fragmentai. Toliau seka nustatoma įterpiant šiuos fragmentus į vektorių su žinoma DNR seka. Pradedant nuo žinomos vektoriaus sekos, seka tęsiama iki nežinomos sekos.
Pabaigus sekų sudarymą, būtina nustatyti persidengiančių sekų sritis. Po to fragmentai sujungiami, kad susidarytų didesni fragmentai, iš pradžių pateikti BAC. Toliau didesni fragmentai surenkami į chromosomą pagal genomo žemėlapį.
01 pav. Klonavimas pagal kloną
Reikšmingas klonavimo klonų sekos privalumas yra tas, kad iš anksto paruoštas genomo žemėlapis padeda patikimai surinkti didesnius fragmentus. Tačiau šio sekos nustatymo metodo trūkumas yra tas, kad genomo žemėlapių generavimas ir klonų kūrimas užima daug laiko. Tačiau šis metodas buvo pasirinktas per „Žmogaus genomo projektą“.
Kas yra Clone by Shotgun Sequencing?
Klonavimas šautuvo sekos nustatymu yra sekos nustatymo metodas, kuris atsitiktinai suskaido DNR sekas į daug mažų fragmentų ir iš naujo surenka seką, stebėdamas persidengiančias sritis. Didesnius žinduolių genomus sunku klonuoti ir surinkti. Taip yra dėl jų struktūros sudėtingumo ir dydžio. Nors klonas klonų sekos nustatymo metodu yra patikimas, sudėtingų organizmų genomų sekvenavimas užtrunka ilgai. Todėl klonavimas šautuvais tapo patikimu pigesniu sekos nustatymo metodu, kurį galima atlikti greičiau. Taigi šiuolaikiniai mokslininkai naudojasi šiuo sekos nustatymo metodu, norėdami išspręsti sudėtingus genomus.
02 pav.: Klonavimas pagal šautuvo seką
Klonuojant pistoleto sekos metodu, įprastiniai genomo kartografavimo ir klonavimo veiksmai nevyksta. Iš pradžių visas genomas yra suskaidytas į įvairaus dydžio nuo 20 kilobazių iki 300 kilobazių. Toliau vyksta sekvenavimas. Tada, naudojant sudėtingą kompiuterinę programinę įrangą, reikia surinkti fragmentus žiūrint į persidengiančius regionus.
Klonavimas šautuvais padeda pagerinti esamų genomo sekų tikslumą. Pagrindinis šio metodo privalumas yra tai, kad jis yra daug greitesnis ir pigesnis nei klonavimo klonų sekos metodas. Tačiau šis procesas neapima genetinio žemėlapio naudojimo. Taigi surinkimo metu klaidų tikimybė yra didesnė. Taigi tai yra didelis trūkumas klonuojant šautuvo sekos metodą.
Kokie yra klonų pagal klonus ir šautuvų sekos panašumai?
- Tiek klonavimas pagal klonų seką, tiek šautuvų sekos nustatymas yra du genomo sekos nustatymo metodai.
- Taikant abu sekos nustatymo metodus, suskaidytų fragmentų surinkimas vyksta identifikuojant persidengiančius regionus.
- Be to, DNR suskaidymas į mažesnius fragmentus būtinas ir klonų, ir šautuvų sekos nustatymui.
Kuo skiriasi sekvenavimas pagal klonus ir šautuvų sekos?
Klonavimas klonų sekos metodu apima du pagrindinius veiksmus: chromosomų kartografavimą ir klonavimą. Priešingai, klonavimas šautuvų sekos nustatymo būdu neatlieka šių dviejų žingsnių; jis atsitiktinai suskaido DNR sekas į daugybę mažų fragmentų ir vėl surenka seką, stebėdamas persidengiančias sritis. Taigi, tai yra pagrindinis skirtumas tarp klonavimo pagal kloną ir šautuvų sekos nustatymo. Dėl šio veiksnio sekvenavimas klonuose po klonų yra brangus ir daug laiko reikalaujantis procesas, o sekvenavimas pagal klonavimą šautuvu yra greitesnis ir pigesnis.
Tačiau klaidų klonavimo metu klonuojant klonų seką mažesnė tikimybė. Taigi jis turi didelį patikimumą. Tačiau klonavimas šautuvų sekos nustatymu yra palyginti mažiau patikimas būdas. Taigi, tai taip pat yra reikšmingas skirtumas tarp klonavimo pagal kloną ir šautuvų sekos nustatymo.
Toliau pateiktame informaciniame paveikslėlyje pateikiama daugiau informacijos apie skirtumą tarp klonų klonų sekos ir šautuvų sekos nustatymo.
Santrauka – klonų seka klonuose prieš šautuvų seką
Apibendrinant skirtumą tarp klonų sekos nustatymo pagal kloną ir sekvenavimo šautuvu, klonas pagal kloną ir sekvenavimas šautuvu yra du genomo sekos nustatymo metodai. Tačiau klonavimas pagal klonų sekos metodą apima ir genomo kartografavimo, ir klonavimo procesus, o klonavimas naudojant sekvenavimą šautuvu – ne. Taigi, tai yra pagrindinis skirtumas tarp klonavimo pagal kloną ir šautuvų sekos nustatymo. Kadangi genomo kartografavimas vyksta klonuojant klonų seką, mažiau tikėtina, kad klaidų susidarys sekų surinkimo metu. Tačiau klonavimas šautuvų sekos nustatymu yra daug greitesnis ir pigesnis procesas. Tačiau jis yra palyginti mažiau patikimas. „Žmogaus genomo projekto“metu pageidaujamas sekvenavimo metodas buvo klonavimas klonų sekos nustatymu. Tačiau šiuolaikinis molekulinis biologas labiau pasikliauja klonavimu šautuvų sekos nustatymu.
