Pagrindinis skirtumas – Šiaurės ir Pietų vs Vakarų blotavimas
Konkrečių DNR, RNR ir b altymų sekų aptikimas yra būtinas įvairių tipų molekulinės biologijos tyrimams. Gelio elektroforezė yra metodas, kuris atskiria DNR, RNR ir b altymus pagal jų dydį. Iš gelio profilių tam tikra DNR seka, RNR seka arba b altymas aptinkamas specialiais metodais, vadinamais blotavimu ir hibridizacija su paženklintais zondais. Yra trys skirtingi blotavimo metodai, būtent pietinis, šiaurinis ir vakarinis. Pagrindinis skirtumas tarp šiaurės pietų ir vakarų blotavimo yra molekulės, kurią jis aptinka iš mėginio, tipas. Southern blot yra metodas, kuris aptinka specifinę DNR seką iš DNR mėginio. Northern blot yra metodas, kuris aptinka specifinę RNR seką iš RNR mėginio. Western blot yra metodas, kuriuo aptinkamas konkretus b altymas iš b altymo mėginio.
Kas yra Southern Blotting?
Southern blotting techniką sukūrė E. M. Southernas 1975 m., siekdamas identifikuoti specifinę DNR seką iš DNR mėginio. Tai pirmasis blotingo metodas, įdiegtas molekulinėje biologijoje. Tai leido aptikti specifinius genus iš DNR, specifinius fragmentus iš DNR ir tt Yra keli Southern blot technikos žingsniai. Jie yra tokie.
- DNR išskiriama iš mėginio ir suardoma restrikcijos endonukleazėmis.
- Suvirškintas mėginys atskiriamas agarozės gelio elektroforeze.
- DNR fragmentai gelyje denatūruojami į atskiras grandines naudojant šarminį tirpalą.
- Vienagrandė DNR pernešama į nitroceliuliozės filtro membraną kapiliariniu būdu.
- Perkelta DNR visam laikui fiksuojama ant membranos.
- Fiksuota DNR ant membranos yra hibridizuojama su paženklintais zondais.
- Neprisijungusi DNR nuplaunama nuo membranos plaunant.
- Rentgeno juosta eksponuojama ant membranos ir paruošiamas autoradiografas.
Southern blotavimas taikomas įvairiems molekulinės biologijos aspektams. Tai naudinga atliekant RFLP kartografavimą, teismo ekspertizės tyrimus, DNR metilinimą genų ekspresijoje, mutavusių genų aptikimą esant genetiniams sutrikimams, DNR pirštų atspaudų ėmimą ir kt.
01 pav.: Southern Blotting metodas
Kas yra Northern Blotting?
Northern blotting yra metodas, skirtas aptikti specifinę RNR seką arba mRNR seką iš mėginio, siekiant ištirti genų ekspresiją. Šią techniką 1979 m. sukūrė Alwine, Kemp ir Stark. Ji skiriasi nuo pietų ir vakarų blotingo metodų dėl kelių žingsnių. Tačiau šis metodas taip pat atliekamas naudojant gelio elektroforezę, blotavimą ir hibridizaciją su konkrečiais pažymėtais zondais ir aptikimą. Northern blotting technika atliekama taip.
- RNR ekstrahuojama iš mėginio ir atskiriama gelio elektroforeze.
- RNR perkeliama iš gelio ant blotingo membranos ir fiksuojama.
- Membrana apdorojama žymėtu zondu, paruoštu iš cDNR arba RNR (zondas papildo tam tikrą mėginio seką).
- Zondas inkubuojamas su membrana, kad susijungtų konkrečia seka.
- Neprisirišę zondai nuplauti.
- Hibridizuoti fragmentai aptinkami autoradiografu.
Northern blotting yra svarbi priemonė nustatant ir kiekybiškai nustatant hibridizuotą mRNR, tiriant RNR degradaciją, įvertinant RNR pusinės eliminacijos periodą, nustatant RNR susijungimą, tiriant genų ekspresiją ir kt.
02 pav.: Northern Blotting
Kas yra Western Blotting?
Western blotting – tai specifinio b altymo aptikimo iš b altymų mišinio metodas, naudojant paženklintus antikūnus. Todėl Western blot taip pat žinomas kaip imunoblotas. Šią metodiką 1979 m. pristatė Towbin ir kt., o dabar ji reguliariai atliekama laboratorijose b altymų analizei. Veiksmai yra tokie.
- Iš mėginio ekstrahuojami b altymai
- B altymai yra atskiriami pagal jų dydį naudojant poliakrilamido gelio elektroforezę
- Atskirtos molekulės elektroporacijos būdu perkeliamos į PVDF membraną arba nitroceliuliozės membraną
- Membrana užblokuota dėl nespecifinio prisijungimo prie antikūnų
- Perkelti b altymai yra susieti su pirminiais antikūnais (fermentu pažymėti antikūnai).
- Membrana nuplaunama, kad būtų pašalinti nespecifiškai surišti pirminiai antikūnai
- Surišti antikūnai aptinkami pridedant substrato ir aptinkant susidariusias spalvotas nuosėdas
Western blotting yra naudingas nustatant antikūnus prieš ŽIV žmogaus serumo mėginyje. Western blot taip pat gali būti naudojamas kaip patvirtinantis hepatito B infekcijos tyrimas ir galutinis karvės pašėlusios ligos testas.
03 paveikslas: Western blotavimas
Kuo skiriasi Northern Southern ir Western Blotting?
Šiaurės prieš pietus vs Western Blotting |
|
| Aptiktos molekulės tipas | |
| Northern Blotting | Northern blotting aptinka specifinę RNR seką iš RNR mėginio. |
| Southern Blotting | Southern blotavimas aptinka specifinę DNR seką iš DNR mėginio. |
| Western Blotting | Vesterno blotavimas aptinka konkretų b altymą iš b altymo mėginio. |
| Gelio tipas | |
| Northern Blotting | Šiam naudojimui naudojamas agarozės/formaldehido gelis. |
| Southern Blotting | Šiam naudojimui naudojamas agarozės gelis. |
| Western Blotting | Šiam naudojimui naudojamas poliakrilamido gelis. |
| Blottavimo metodas | |
| Northern Blotting | Tai yra kapiliarinis perkėlimas. |
| Southern Blotting | Tai yra kapiliarinis perkėlimas. |
| Western Blotting | Tai elektrinis pervedimas. |
| Naudojami zondai | |
| Northern Blotting | cDNR arba RNR zondai, pažymėti radioaktyviai arba neradioaktyviai. |
| Southern Blotting | DNR zondai paženklinti radioaktyviai arba neradioaktyviai. |
| Western Blotting | Pirminiai antikūnai naudojami kaip zondai. |
| Aptikimo sistema | |
| Northern Blotting | Tai atliekama naudojant autoradiografą arba aptinkant šviesos ar spalvos pasikeitimą. |
| Southern Blotting | Tai atliekama naudojant autoradiografą, aptinkant šviesos arba spalvos pasikeitimą. |
| Western Blotting | Tai atliekama naudojant šviesos arba spalvos pasikeitimo aptikimą. |
Santrauka – Šiaurės ir Pietų prieš Vakarų blotavimą
Blottavimas yra speciali technika, sukurta specifinei DNR, RNR ar b altymo identifikavimui iš mėginių. Yra trys atskiros blotavimo procedūros, būtent šiaurinė, pietinė ir vakarinė, skirtos tam tikro tipo molekulėms aptikti. Northern blotting metodas skirtas aptikti specifinę RNR seką iš RNR mišinio. Southern blotting metodas leidžia aptikti konkrečią DNR seką iš DNR mėginio, o Western blot metodas yra sukurtas siekiant identifikuoti specifinį b altymą iš b altymų mišinio.
