Pagrindinis skirtumas – Sangerio sekos ir pirosequencing
DNR sekos nustatymas yra labai svarbus DNR analizei, nes žinios apie teisingą nukleotidų išdėstymą tam tikroje DNR srityje atskleidžia daug svarbios informacijos apie ją. Yra įvairių DNR sekos nustatymo metodų. Sanger sekos ir Pyrosequencing yra du skirtingi DNR sekos nustatymo metodai, plačiai naudojami molekulinėje biologijoje. Pagrindinis skirtumas tarp „Sanger“sekos nustatymo ir „pyrosequencing“yra tas, kad „Sanger“sekos nustatymas naudoja dideoksinukleotidus, kad nutrauktų DNR sintezę, kad būtų galima nuskaityti nukleotidų seką, o pirosekvencija aptinka pirofosfato išsiskyrimą įtraukdama nukleotidus ir sintetindama komplementarią seką, kad būtų galima nuskaityti tikslią sekos tvarką.
Kas yra Sangerio sekos nustatymas?
Sangerio sekos nustatymas yra pirmosios kartos DNR sekos nustatymo metodas, kurį 1977 m. sukūrė Frederickas Sangeris ir jo kolegijos. Jis taip pat žinomas kaip grandinės nutraukimo sekos arba dideoksi sekvenavimas, nes jis pagrįstas grandinės nutraukimu dideoksinukleotidais (ddNTP). Šis metodas buvo plačiai naudojamas daugiau nei 30 metų, kol buvo sukurtas naujos kartos sekvenavimas (NGS). Sangerio sekos nustatymo technika leido atrasti teisingą nukleotidų tvarką arba prijungti tam tikrą DNR fragmentą. Jis pagrįstas selektyviu ddNTP įtraukimu ir DNR sintezės nutraukimu DNR replikacijos in vitro metu. Unikali ddNTP savybė yra 3'OH grupių nebuvimas, kad būtų tęsiamas fosfodiesterio jungties susidarymas tarp gretimų nukleotidų. Taigi, prijungus ddNTP, grandinės pailgėjimas nutrūksta ir nuo to momento baigiasi. Yra keturi ddNTP – ddATP, ddCTP, ddGTP ir ddTTP – naudojami Sangerio sekoje. Šie nukleotidai sustabdo DNR replikacijos procesą, kai jie yra įtraukiami į augančią DNR grandinę ir lemia įvairaus ilgio trumpą DNR. Kapiliarinė gelio elektroforezė naudojama šioms trumpoms DNR grandinėms suskirstyti pagal jų dydį gelyje, kaip parodyta 01 paveiksle.
1 pav. Susintetintos trumpos DNR kapiliarinė gelio elektroforezė
DNR replikacijai in vitro turėtų būti keliami keli reikalavimai. Tai yra DNR polimerazės fermentas, šabloninė DNR, oligonukleotidų pradmenys ir deoksinukleotidai (dNTP). Taikant Sanger sekvenavimą, DNR replikacija atliekama keturiuose atskiruose mėgintuvėliuose kartu su keturių tipų ddNTP atskirais. Deoksinukleotidai nėra visiškai pakeisti atitinkamais ddNTP. Tam tikro dNTP mišinys (pavyzdžiui, dATP + ddATP) įtraukiamas į mėgintuvėlį ir pakartojamas. Keturi atskiri mėgintuvėlio produktai paleidžiami ant gelio keturiuose atskiruose šuliniuose. Tada, nuskaitant gelį, seka gali būti sudaryta, kaip parodyta 02 paveiksle.
02 pav. Sangerio seka
Sangerio sekos nustatymas yra svarbus metodas, padedantis daugelyje molekulinės biologijos sričių. Žmogaus genomo projektas buvo sėkmingai užbaigtas naudojant Sanger sekos nustatymo metodus. Sangerio sekos nustatymas taip pat naudingas nustatant tikslinę DNR seką, vėžio ir genetinių ligų tyrimus, genų ekspresijos analizę, žmogaus identifikavimą, patogenų aptikimą, mikrobų seką ir kt.
Yra keletas „Sanger“sekos trūkumų:
- Sekvenuojamos DNR ilgis negali būti ilgesnis nei 1000 bazinių porų
- Vienu metu galima sekti tik vieną kryptį.
- Procesas užima daug laiko ir yra brangus.
Todėl laikui bėgant buvo sukurti nauji pažangūs sekos nustatymo metodai, siekiant išspręsti šias problemas. Tačiau Sangerio sekos nustatymas vis dar naudojamas dėl labai tikslių rezultatų iki maždaug 850 bazinių porų ilgio fragmentų.
Kas yra pirosequencing?
Pirozekvenavimas yra nauja DNR sekos nustatymo technika, pagrįsta „sekvenavimu sintezės būdu“. Šis metodas pagrįstas pirofosfato išsiskyrimo nustatymu įterpus nukleotidą. Procesą naudoja keturi skirtingi fermentai: DNR polimerzė, ATP sulfurilazė, luciferazė ir apirazė ir du substratai – adenozino 5’ fosfosulfatas (APS) ir luciferinas.
Procesas prasideda pradmenų surišimu su vienos grandinės DNR šablonu, o DNR polimerazė pradeda jį papildančių nukleotidų įtraukimą. Kai nukleotidai susijungia (nukleorūgščių polimerizacija), išskiria pirofosfato (dvi fosfatų grupės susijungusios) grupes ir energiją. Kiekvienas nukleotido pridėjimas išskiria ekvimolinį pirofosfato kiekį. Pirofosfatas virsta ATP, veikiant ATP sulfurilazei, esant substratui APS. Sukurtas ATP skatina luciferazės sukeltą luciferino konversiją į oksiluciferiną, todėl matomos šviesos kiekis yra proporcingas ATP kiekiui. Šviesa aptinkama fotonų aptikimo įtaisu arba fotodaugintuvu ir sukuria pirogramą. Apirazė skaido ATP ir į reakcijos mišinį neįtrauktus dNTP. dNTP pridėjimas atliekamas vieną kartą. Kadangi nukleotido pridėjimas yra žinomas pagal šviesos įtraukimą ir aptikimą, galima nustatyti šablono seką. Pirograma naudojama DNR mėginio nukleotidų sekai generuoti, kaip parodyta 03 paveiksle.
Pirozekvenavimas yra labai svarbus vieno nukleotido polimorfizmo analizei ir trumpų DNR atkarpų sekos nustatymui. Didelis tikslumas, lankstumas, automatizavimo paprastumas ir lygiagretus apdorojimas yra pirosekvenavimo pranašumai, palyginti su Sanger sekos technikomis.
03 pav.: Pirosekvencija
Kuo skiriasi Sanger Sequencing ir Pyrosequencing?
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Sangerio sekos nustatymas yra DNR sekos nustatymo metodas, pagrįstas selektyviu ddNTP įtraukimu DNR polimerazės būdu ir grandinės nutraukimu. | Pirozekvenavimas yra DNR sekos nustatymo metodas, pagrįstas pirofosfato išsiskyrimo įterpus nukleotidą nustatymu. |
| ddNTP naudojimas | |
| ddNTP naudojami DNR replikacijai nutraukti | ddNTP nenaudojami. |
| Įtraukti fermentai | |
| Naudojama DNR polimerazė. | Naudojami keturi fermentai: DNR polimerazė, ATP sulfurilazė, liuciferazė ir apirazė. |
| Naudojami substratai | |
| APS ir Luciferin nenaudojami. | Naudojamas adenozino 5' fosfosulfatas (APS) ir liuciferinas. |
| Maksimali temperatūra | |
| Tai lėtas procesas. | Tai greitas procesas. |
Santrauka – Sangerio sekvencija prieš pirosequencing
Sangerio sekos nustatymas ir pirosequencing yra du DNR sekos nustatymo metodai, naudojami molekulinėje biologijoje. Sangerio sekos nustatymas nustato nukleotidų eiliškumą, nutraukdamas grandinės pailgėjimą, o pirosekvenavimas sukuria tikslią nukleotidų eilės tvarką, įtraukdamas nukleotidus ir nustatydamas pirofosfatų išsiskyrimą. Todėl pagrindinis skirtumas tarp „Sanger“sekos nustatymo ir „pyrosequencing“yra tas, kad „Sanger“sekos nustatymas veikia sekos nustatymui nutraukiant grandinę, o pirosequencing – sekos nustatymui sintezės būdu.
