Pagrindinis skirtumas – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotidai yra pagrindiniai DNR struktūriniai vienetai ir statybiniai blokai. DNR molekulė sudaryta iš polinukleotidų grandinės. DNR yra keturi skirtingi nukleotidai. Šiuos nukleotidus sudaro keturios skirtingos azoto bazės, pavadintos A (adeninas), G (guaninas), C (citozinas), T (timinas). Nukleotidų tvarka DNR molekulėje turi didelę reikšmę, nes ji koduoja svarbią genetinę informaciją organizmų augimui ir vystymuisi. DNR sekos nustatymas reiškia procesą, kurio metu nustatoma tiksli DNR nukleotidų seka. Yra įvairių DNR sekos nustatymo metodų. Maxam Gilbert sekos nustatymas ir Sangerio DNR sekos nustatymas yra du DNR sekos nustatymo metodai, priklausantys pirmosios kartos sekos nustatymui. „Maxam Gilbert“sekos nustatymo procedūra nustato bazinę seką, chemiškai suskaidant 5’ galo pažymėtus DNR fragmentus, pirmiausia kiekviename iš keturių nukleotidų ir gelio elektroforezės būdu. Sangerio sekos nustatymo procedūra nustato nukleotidų seką, sintezuojant viengrandę DNR naudojant DNR polimerazę ir dideoksinukleotidus bei gelio elektroforezę. Tai yra pagrindinis skirtumas tarp Maxam Gilbert ir Sanger Sequencing.
Kas yra Maxam Gilbert sekvencija?
Maxamo Gilberto sekos nustatymas, taip pat žinomas kaip cheminis sekos nustatymo metodas, yra metodas, sukurtas siekiant nustatyti nukleotidų tvarką DNR. Šį metodą 1976 m. pristatė W alteris Gilbertas ir Alanas Maxamas ir jis išpopuliarėjo, nes jį galima atlikti tiesiogiai naudojant išgrynintą DNR. Maxam Gilbert metodas priklauso pirmosios kartos DNR sekos nustatymui ir buvo pirmasis mokslininkų plačiai naudojamas sekos nustatymo metodas.
Pagrindinis šio metodo principas yra pažymėtų DNR fragmentų ribojimas tam tikrose bazėse, naudojant bazei specifines chemines medžiagas ir sąlygas bei pažymėtų fragmentų atskyrimas elektroforezės būdu, kaip parodyta 01 paveiksle. Fragmentai atskiriami pagal iki jų dydžių ant gelio. Kadangi fragmentai yra paženklinti, DNR molekulės seką galima lengvai nustatyti.
Maxam Gilbert metodas naudoja specifines bazines chemines medžiagas, kad sulaužytų DNR tam tikrose bazėse. Du įprastiniai chemikalai, vadinami dimetilsulfatu ir hidrazinu, yra naudojami selektyviai atakuoti purinus ir pirimidinus.
Maxamo Gilberto sekos nustatymo metodas atliekamas keliais etapais, kaip nurodyta toliau.
- DNR sekos išgryninimas naudojant restrikcijos endonukleazes
- DNR fragmentų galų ženklinimas pridedant radioaktyviųjų fosfatų
- Pažymėtų fragmentų išvalymas nuo nepažymėtų fragmentų gelio elektroforezės būdu
- Galu pažymėtos DNR atskyrimas į keturis mėgintuvėlius ir apdorojimas bazinėms specifinėmis cheminėmis medžiagomis atskirai
- Kiekvieno mėgintuvėlio turinio elektroforezė ant atskirų linijų ant gelio ir fragmentų atskyrimas pagal jų ilgį.
- Fragmentų aptikimas autoradiografu.
01 paveikslas: Maksimo Gilberto seka
Kas yra Sangerio sekos nustatymas?
Sanger Sequencing yra sekos nustatymo metodas, kurį 1977 m. sukūrė Frederickas Sangeris ir jo kolegos, kad nustatytų tam tikro DNR fragmento bazinę seką. Jis taip pat žinomas kaip grandinės nutraukimo sekos arba dideoksi sekos metodas. Šis metodas veikia remiantis selektyvaus grandinės užbaigimo dideoksinukleotidų (ddNTP), tokių kaip ddGTP, ddCTP, ddATP ir ddTTP, įtraukimo į DNR polimerazę principu, kai sintezuojama viengrandė DNR, kad būtų nutrauktas grandinės formavimasis. Dideoksinukleotidams trūksta 3’ OH grupių, kad susidarytų fosfodiesterio ryšiai su gretimu nukleotidu. Vadinasi, gijos formavimasis sustoja, kai ddNTP įtraukiamas į naujai besiformuojančią grandinę sanger sekos metu.
Šiuo metodu keturiose atskirose DNR sintezės reakcijos (PGR) atliekamos keturiuose atskiruose mėgintuvėliuose su vieno tipo ddNTP. Kiti reikalavimai taip pat pateikiami PGR mėgintuvėliams, įskaitant pradmenis, dNTP, Taq polimerazę, specifines sąlygas ir kt. Keturiose mėgintuvėliuose su keturiais mišiniais atliekamos keturios atskiros reakcijos. Po PGR reakcijų gauti DNR fragmentai termiškai denatūruojami ir atskiriami gelio elektroforezės būdu. Tada fragmentai vizualizuojami naudojant pažymėtą (radioaktyvų arba fluorescencinį) pradmenį arba dNTP, kaip parodyta 02 paveiksle.
02 pav. Sangerio seka
Kuo skiriasi Maxam Gilbert ir Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxamo Gilberto sekos nustatymas yra pirmoji DNR sekos nustatymo metodika. | Sangerio sekos nustatymo metodas buvo pristatytas po Maxamo Gilberto sekos nustatymo metodo. |
| Naudojimas | |
| Šis metodas naudojamas retai. | Sangerio seka įprastai naudojama sekai nustatyti. |
| Pavojingų cheminių medžiagų naudojimas | |
| Naudojamos pavojingos cheminės medžiagos. | Pavojingų cheminių medžiagų naudojimas yra ribotas, palyginti su Maxam Gilbert metodu. |
| Aptikimo žymėjimas | |
| Šis metodas naudoja radioaktyvųjį P32 DNR fragmentų galams pažymėti. | Sangerio sekos nustatymui naudojami radioaktyviai arba fluorescenciniu būdu pažymėti ddNTP. |
Santrauka – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxamo Gilberto ir Sangerio sekos nustatymas yra dviejų tipų DNR sekos nustatymo metodai, kuriems taikomas pirmosios kartos DNR sekos nustatymas. Maxam Gilbert sekos nustatymas yra pirmasis DNR sekos nustatymo metodas 1976 m. ir jis atliekamas suskaidant galus pažymėtus DNR fragmentus bazei būdingomis cheminėmis medžiagomis. Todėl jis žinomas kaip cheminis sekvenavimas. Sangerio sekos nustatymo metodas buvo pristatytas 1977 m. ir yra pagrįstas ddNTP varomomis grandinės nutraukimo reakcijomis. Sangerio sekos nustatymo metodas yra populiarus nei Maxam Gilbert metodas dėl kelių Maxam Gilbert metodo trūkumų, tokių kaip per didelis laiko sąnaudos, pavojingų cheminių medžiagų naudojimas ir kt. Tai yra skirtumas tarp Maxam Gilbert ir Sanger sekos.
