Pagrindinis skirtumas – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green ir Taqman yra du metodai, naudojami realaus laiko PGR amplifikacijos procesui aptikti arba stebėti. SYBR Green yra metodas, pagrįstas nukleino rūgšties dažymo dažais, o Taqman yra metodas, pagrįstas hidrolizės zondu. Abi technologijos skirtos generuoti fluorescenciją PGR metu, o tai leidžia PGR įrenginiui realiuoju laiku stebėti reakciją „realiu laiku“. SYBR Green metodas atliekamas naudojant fluorescencinį dažą, vadinamą SYBR green, ir nustato amplifikaciją, sujungdamas dažus su pagaminta dvigrandė DNR. Taqman atliekamas naudojant dvigubai pažymėtus zondus ir aptinka amplifikaciją zondui skaidant Taq polimeraze ir fluoroforo išsiskyrimą. Tai yra pagrindinis skirtumas tarp SYBR Green ir Taqman.
Kas yra SYBR Green?
SYBR Green yra fluorescenciniai dažai, naudojami nukleorūgščių, ypač dvigrandžių DNR, dažymui molekulinėje biologijoje. SYBR Green metodas naudojamas PGR produktų kiekybiniam įvertinimui realiojo laiko PGR metu. Susijungęs su DNR, susidaręs DNR ir dažų kompleksas sugeria mėlyną šviesą ir skleidžia intensyvią žalią šviesą. Taip atsitinka dėl struktūrinių pokyčių, atsirandančių dažų molekulėje susijungus su dvigrande DNR. Kai PGR sukuria vis daugiau DNR, daugiau dažų molekulių jungiasi su DNR ir sukuria daugiau fluorescencijos. Todėl fluorescencija didėja, kai kaupiasi PGR produktas. Taigi, PGR produkto kiekis gali būti kiekybiškai išmatuotas naudojant SYBR Green fluorescencijos aptikimą.
SYBR žali dažai taip pat gali būti naudojami DNR žymėjimui citometrijoje ir fluorescencinėje mikroskopijoje. Etidžio bromidas buvo sėkmingai pakeistas SYBR Green, nes etidžio bromidas yra kancerogeninis dažiklis, turintis problemų dėl šalinimo atliekant DNR vizualizavimą gelio elektroforezės metu.
Yra SYBR žaliojo metodo privalumų ir trūkumų. Šis metodas yra labai jautrus, nebrangus ir paprastas naudoti. Tačiau dėl nespecifinio surišimo gebėjimo prisijungti prie bet kokios dvigrandės DNR, PGR produkto kiekis gali būti per didelis.
01 pav.: SYBR ekologiška technika
Kas yra Taqman?
Taqman yra alternatyvus SYBR Green būdas stebėti PGR procesą realiuoju laiku. Šis metodas priklauso nuo Taq polimerazės fermento 5’–3’ egzonukleazės aktyvumo, kad suardytų zondus naujos grandinės išplėtimo ir fluoroforo išsiskyrimo metu. Šiame metode naudojami dvigubai pažymėti zondai ir jis pagrįstas zondų hidrolize. Zondai yra fluorescenciniu būdu pažymėti DNR oligonukleotidai, turintys fluorescencinę reporterio molekulę (fluoroforą) 5' gale ir gesinimo molekulę 3' gale. Jie skirti prisirišti prie viengubo šablono priešingoje grunto atkaitinimo pusėje. Taq polimerazė prideda nukleotidų į pradmenį ir pratęsia naują grandinę link dvigubai pažymėtų zondų. Kai Taq polimerazė susitinka su zondu, Taq polimerazės eksonukleazės veikimas suaktyvina ir suardo zondą. Baigus naujos grandinės sintezę, zondas visiškai suyra ir atpalaiduoja fluoroforą. Fluoroforo išsiskyrimas sukuria fluorescenciją. Fluorescentinė Quencher molekulė efektyviai gesina skleidžiamą šviesą ir sukuria išvestį PGR produkto kiekybiniam įvertinimui. Fluoroforų išsiskyrimas ir PGR produktų kiekis yra proporcingi. Taigi, kiekybinį įvertinimą galima lengvai atlikti Taqman metodu.
02 paveikslas: Taqman metodas
Taqman metodas naudojamas realiuoju laiku PGR, genų ekspresijos kiekybiniam įvertinimui, genetinių polimorfizmų nustatymui, chromosomų DNR delecijų kiekybiniam įvertinimui, bakterijų identifikavimui, mikrogardelių analizės patikrinimui, SNP genotipų nustatymui ir kt.
Kuo skiriasi SYBR green ir Taqman?
SYBR Green prieš Taqman |
|
| SYBR Green yra pagrįstas DNR surišančiais dažais. | Taqman priklauso nuo hibridizacijos zondų ir 5’–3’ Taq polimerazės egzonukleazės aktyvumo. |
| Fluorescenciniu būdu pažymėti zondai | |
| Fluorescenciniu būdu pažymėtų zondų nereikia. | Reikalingi dvigubai pažymėti zondai. |
| Multiplex genų analizė | |
| Jo negalima naudoti multipleksiniams genų taikiniams. | Jis gali būti naudojamas multipleksiniams genų taikiniams. |
| Kaina | |
| Tai pigiau. | Tai brangiau. |
| Specifiškumas | |
| Tai mažiau specifiška ir jungiasi su bet kokia dviguba DNR | Jie yra labai specifiniai, nes zondai aptinka specifinius stiprinimo produktus. |
| Efektyvumas | |
| Tai mažiau efektyvu. | Tai labai efektyvu. |
| Programa | |
| Tai naudojama realaus laiko PGR, agarozės gelio vizualizavimui, DNR žymėjimui ir kt. | Tai naudojama realaus laiko PGR, genų ekspresijos kiekybiniam įvertinimui, genetinių polimorfizmų aptikimui ir kt. |
Santrauka – SYBR Green ir Taqman
Taqman ir SYBR green yra du metodai, naudojami realaus laiko PGR (kiekybinei PGR). Abu metodai leidžia efektyviai kiekybiškai įvertinti PGR produktą ir priklauso nuo fluorescencijos spinduliavimo. Taqman metodas naudoja dvigubai paženklintus zondus sukauptai DNR aptikti, o SYBR Green metodas naudoja fluorescencinius dažus. Abu šie metodai taip pat skirtingai taikomi molekulinėje biologijoje.
