Pagrindinis skirtumas – NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) ir Sanger Sequencing yra dviejų tipų nukleotidų sekos nustatymo metodai, sukurti bėgant laikui. Sanger Sequencing metodas buvo plačiai naudojamas daugelį metų, o NGS neseniai jį pakeitė dėl savo pranašumų. Pagrindinis skirtumas tarp NGS ir Sanger Sequencing yra tas, kad NGS veikia pagal principą: vienu metu per sekos nustatymo sistemą greitai seka milijonus sekų, o Sanger Sequencing veikia grandinės nutraukimo principu dėl selektyvios dideoksinukleotidų įtraukimo į DNR polimerazės fermentą. DNR replikacijos metu ir dėl to fragmentų atskyrimo kapiliarine elektroforeze.
Kas yra nukleotidų sekos nustatymas?
Genetinė informacija saugoma organizmo DNR arba RNR nukleotidų sekose. Nukleotidų eilės nustatymo procesas (naudojant keturias bazes) tam tikrame fragmente (gene, genų grupėje, chromosomoje ir pilname genome) yra žinomas kaip nukleotidų sekos nustatymas. Labai svarbu genominiuose tyrimuose, teismo ekspertizėse, virusologijoje, biologinėje sisteminėje, medicininėje diagnostikoje, biotechnologijoje ir daugelyje kitų sričių analizuoti genų struktūrą ir funkcijas. Yra įvairių mokslininkų sukurtų sekos nustatymo metodų. Tarp jų 1977 m. Fredericko Sangerio sukurta „Sanger“sekvencija buvo plačiai naudojama ir populiarinama ilgą laiką, kol ją pakeitė „Next Generation Sequencing“.
Kas yra NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) yra terminas, vartojamas apibūdinti šiuolaikinius didelio našumo sekos nustatymo procesus. Jame aprašomos įvairios šiuolaikinės sekos nustatymo technologijos, kurios padarė perversmą genominiuose tyrimuose ir molekulinėje biologijoje. Šie metodai yra „Illumina“sekos nustatymas, „Roche 454“sekos nustatymas, „Ion Proton“sekos nustatymas ir „SOLiD“(„Sequencing by Oligo Ligation Detection“) sekos nustatymas. NGS sistemos yra greitesnės ir pigesnės. NGS sistemose naudojami keturi pagrindiniai DNR sekos nustatymo metodai; pirosekvenavimas, sekos nustatymas sintezės būdu, sekvenavimas ligavimu ir jonų puslaidininkių sekvenavimas. Daugybė DNR arba RNR grandinių (milijonai) gali būti sekvenuoti lygiagrečiai. Tai leidžia per trumpą laiką nustatyti viso organizmų genomo seką, skirtingai nuo Sanger sekos, kuri užtrunka ilgiau.
NGS turi daug pranašumų, palyginti su įprastu Sangerio sekos nustatymo metodu. Tai greitas, tikslesnis ir ekonomiškesnis procesas, kurį galima atlikti naudojant mažą imties dydį. NGS gali būti naudojamas atliekant metagenominius tyrimus, nustatant individualaus genomo variacijas dėl intarpų ir ištrynimų ir pan. bei analizuojant genų išraiškas.
1 pav.: NGS sekos raida
Kas yra Sangerio sekos nustatymas?
Sanger Sequencing yra sekos nustatymo metodas, kurį 1977 m. sukūrė Frederickas Sangeris ir jo kolegos, siekiant nustatyti tikslią tam tikro DNR fragmento nukleotidų tvarką. Jis taip pat žinomas kaip grandinės nutraukimo seka arba dideoksi sekvencija. Šio metodo veikimo principas yra grandinės sintezės nutraukimas, DNR replikacijos metu DNR polimeraze selektyviai įtraukiant grandinę baigiančius dideoksinukleotidus (ddNTP), tokius kaip ddGTP, ddCTP, ddATP ir ddTTP. Normalūs nukleotidai turi 3' OH grupes, kad susidarytų fosfodiesterio ryšys tarp gretimų nukleotidų ir tęstų grandinės formavimąsi. Tačiau ddNTP trūksta šios 3' OH grupės ir jie negali sudaryti fosfodiesterio jungčių tarp nukleotidų. Taigi grandinės pailgėjimas nutrūksta.
Šiuo metodu sekvenuojama vienos grandinės DNR naudojama kaip šabloninė DNR sintezės in vitro grandinė. Kiti reikalavimai yra oligonukleotidų pradmenys, deoksinukleotidų pirmtakai ir DNR polimerazės fermentas. Kai žinomi tikslinio fragmento šoniniai galai, pradmenys gali būti lengvai sukurti DNR replikacijai. Keturiose atskiruose mėgintuvėliuose atliekamos keturios atskiros DNR sintezės reakcijos. Kiekvienas vamzdelis turi atskirus ddNTP kartu su kitais reikalavimais. Iš konkretaus nukleotido pridedamas dNTP ir ddNTP mišinys. Taip pat keturios atskiros reakcijos atliekamos keturiuose mėgintuvėliuose su keturiais mišiniais. Po reakcijų atliekamas DNR fragmentų aptikimas ir fragmento rašto pavertimas sekos informacija. Gauti DNR fragmentai termiškai denatūruojami ir atskiriami gelio elektroforezės būdu. Jei naudojami radioaktyvūs nukleotidai, juostų raštą poliakrilamido gelyje galima vizualizuoti autoradiografijos būdu. Kai naudojant šį metodą naudojami fluorescenciniu būdu pažymėti dideoksinukleotidai, jį galima sušvelninti gelio nuskaitymo metu ir praleisti per lazerio spindulį, kurį aptiks fluorescencinis detektorius. Siekiant išvengti klaidų, kurios gali kilti, kai seka nuskaitoma akimis ir rankiniu būdu įvedama į kompiuterį, šis metodas buvo sukurtas naudojant automatinį sekvencinį įrenginį, sujungtą su kompiuteriu.
Tai metodas, naudojamas žmogaus genomo projekto DNR sekai nustatyti. Šis metodas vis dar naudojamas su išplėstiniais pakeitimais, nes jis suteikia tikslią sekos informaciją, nepaisant to, kad procesas yra brangus ir lėtas.
2 pav.: Sangerio seka
Kuo skiriasi NGS ir Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) reiškia šiuolaikinius didelio našumo sekos nustatymo procesus. Jame aprašomos įvairios šiuolaikinės sekos nustatymo technologijos | Sanger Sequencing yra sekos nustatymo metodas, kurį sukūrė Frederickas Sangeris, siekiant nustatyti tikslią tam tikro DNR fragmento nukleotidų tvarką. |
| Kaštų efektyvumas | |
| NGS yra pigesnis procesas, nes jis sumažina laiką, žmogaus jėgą ir chemikalus. | Tai brangus procesas, nes reikia laiko, žmogaus jėgos ir daugiau cheminių medžiagų. |
| Greitis | |
| Tai greičiau, nes tiek cheminis aptikimas, tiek signalo aptikimas daugelyje gijų vyksta lygiagrečiai. | Tai užtrunka, nes cheminis aptikimas ir signalo aptikimas vyksta kaip du atskiri procesai ir vienu metu gali nuskaityti tik juosta. |
| Patikimumas | |
| NGS yra patikimas. | Sangerio sekos nustatymas mažiau patikimas |
| Pavyzdžio dydis | |
| NGS reikia mažiau DNR. | Šiam metodui reikia daug DNR šablono. |
| DNR bazių sekvenuotame fragmente | |
| DNR bazių skaičius viename sekvenuotame fragmente yra mažesnis nei Sangerio metodu | Sekų generavimas yra ilgesnis nei NGS sekos. |
Santrauka – NGS vs Sanger Sequencing
NGS ir Sanger Sequencing yra nukleotidų sekos nustatymo metodai, plačiai naudojami molekulinėje biologijoje. „Sanger“sekos nustatymas yra ankstyvas sekos nustatymo metodas, kurį pakeitė NGS. Pagrindinis skirtumas tarp NGS ir „Sanger Sequencing“yra tas, kad NGS yra greitas, tikslesnis ir ekonomiškesnis procesas nei „Sanger“sekos nustatymas. Abu metodai sukėlė didelius genetikos ir biotechnologijų protrūkius.
