Pagrindinis skirtumas – klonavimas ir subklonavimas
Klonavimas ir subklonavimas yra molekulinės biologinės procedūros, kuriomis sukuriamos genetiškai identiškos ląstelės arba organizmai, turintys dominančią DNR arba geną. Klonavimas yra metodas, apimantis suinteresuoto geno arba DNR įterpimą į vektorių, jo replikaciją šeimininko bakterijoje ir ląstelių arba organizmų, kurie yra tikslios genetinės struktūros kopijos, gamybą. Subklonavimas yra metodas, apimantis dominančio geno, kuris jau yra įterptas į vektorių, įterpimą į antrinį vektorių, jo replikaciją šeimininko bakterijoje ir genetiškai identiškų ląstelių arba organizmų kopijų gamybą.pagrindinis skirtumas tarp klonavimo ir subklonavimo yra tas, kad klonuojant dominantis genas, surištas į vektorių, tęsia klonavimo procesą, o subklonuojant jau klonuotas dominantis genas yra atskiriamas nuo pirminio vektoriaus ir vėl įterpiamas į gavėjo vektorių ir tęskite procesą.
Kas yra klonavimas?
Klonavimas – tai procedūra, kuri gamina genetiškai identiškus organizmus arba ląsteles. Gamtoje klonavimas vyksta nelytinio dauginimosi priemonėmis. Kai nėra genetinės rekombinacijos ar pakitimų, dukterinės ląstelės gauna tą pačią genetinę sudėtį kaip ir tėvų. Prokariotiniai ir eukariotai organizmai kuria klonus dvejetainiu dalijimusi, pumpurų atsiradimu, mitoze ir pan. Molekulinėje biologijoje genų arba specifinių DNR fragmentų klonavimas yra populiarus metodas tos konkrečios DNR dalies struktūrai ir funkcijoms tirti.
Pagrindinis molekulinio klonavimo tikslas – padaryti milijonus genetiškai identiškų ląstelių arba organizmų, turinčių dominantį DNR fragmentą (daugiausia genų), kopijų. Jis sukuria organizmus su tiksliomis kito genetinėmis kopijomis. Visų pirma specifiniai genai klonuojami atliekant molekulinius tyrimus, siekiant gauti struktūrinę ir funkcinę informaciją bei nustatyti DNR seką. Be to, norint gaminti didelius specifinius b altymus ar produktus, plačiai naudojamas klonavimas.
Klonavimo procedūra
Pagrindiniai klonavimo procedūros žingsniai yra tokie.
- Dominčio geno identifikavimas ir išskyrimas. (Dominamojo geno amplifikacija PGR būdu).
- Dominčio geno restrikcinis virškinimas (restrikcijos endonukleazė nupjauna geną).
- Vektoriaus DNR suskaidymas. (Vektoriaus DNR taip pat supjaustoma naudojant tą pačią restrikcijos endonukleazę).
- Geno įterpimas į vektorių ir rekombinantinės molekulės formavimas.
- Rekombinantinio vektoriaus transformacija į šeimininko bakteriją.
- Transformuotų bakterijų išskyrimas ir identifikavimas (plazmidės vektoriuje turi būti atrenkamas genas, dažniausiai atsparumo antibiotikams genas, skirtas transformuotų bakterijų atrankai).
- Rekombinantinio geno ekspresija šeimininko viduje.
Paveikslėlis_01: Klonavimo procedūra
Kas yra subklonavimas?
Subklonavimas – tai dominančio geno perkėlimas iš vieno vektoriaus į kitą, norint pamatyti geno ekspresiją ir įgyti pageidaujamą geno funkcionalumą. Taikant šį metodą, naudojami du vektoriai; būtent pirminis vektorius ir paskirties vektorius. Klonuoti intarpai vėl perkeliami į antrąjį subklonavimo vektorių. Geno perkėlimo iš pirmojo vektoriaus į antrąjį vektorių tikslas yra gauti tai, ko negalėjo padaryti pirmasis vektorius, arba vėl atskirti geną jau klonuotame DNR fragmente ir išreikšti jį vieną. Šios procedūros pradžioje naudojami restrikcijos fermentai.
Subklonavimo procedūra
Pagrindiniai subklonavimo žingsniai yra tokie.
- Padedant restrikcijos endonukleazėms, dominančios DNR atskyrimas donoro plazmidėje (pirminiame vektoriuje).
- Tikiosios DNR amplifikacija naudojant PGR.
- PGR produkto (dominančios DNR) išgryninimas gelio elektroforeze.
- Greipientės plazmidės atidarymas naudojant tas pačias restrikcijos endonukleazes, kurios buvo naudojamos norint atskirti dominančią DNR pirminėje plazmidėje.
- Dominčios DNR (geno) sujungimas į recipiento plazmidę, kad būtų sukurta subklonuota plazmidė.
- Subklonuoto vektoriaus pavertimas kompetentinga šeimininko bakterija.
- Transformuotų ląstelių atranka.
- Plazmidinės DNR išgryninimas ir naudojimas DNR sekos nustatymui arba genų ekspresijai, norint gauti norimus produktus.
Subklonavimas atliekamas tais atvejais, kai iš klonuotų genų grupės išskiriamas vienas genas arba kai dominantį geną reikia perkelti į naudingą plazmidę, kad būtų galima pamatyti tikslią dominančio geno funkciją.
Paveikslėlis_02: Subklonavimo procedūra
Kuo skiriasi klonavimas ir subklonavimas?
Klonavimas prieš subklonavimą |
|
| Klonavimas yra procedūra, kurios metu gaminami genetiškai identiški organizmai arba ląstelės. | Subklonavimas – tai dominančio geno perkėlimo iš vieno vektoriaus į kitą procedūra, siekiant pamatyti geno ekspresiją ir įgyti pageidaujamą geno funkcionalumą. |
| Apdoroti | |
| Atskirkite dominančią DNR nuo organizmo, vieną kartą įterpkite į vektorių ir klonuokite | Jau klonuota DNR atskiriama nuo pirmojo vektoriaus ir įterpiama į antrąjį vektorių bei klonuojama. |
| Įterpti judėjimą per vektorius | |
| Neperkelia intarpų (dominančios DNR) iš vieno vektoriaus į kitą. | Perkelti įterpimus iš pirminio vektoriaus į paskirties vektorių. |
Santrauka – klonavimas prieš subklonavimą
Klonuojant sukuriamos genetiškai identiškos ląstelės arba organizmai su įterptu genu arba dominančiu DNR. Jis vyksta per dominančios DNR atskyrimą ir įterpimą į vektorių ir ekspresiją šeimininko bakterijoje. Subklonavimas atlieka panašius veiksmus kaip ir klonavimas. Tačiau subklonuojant jau klonuotas DNR fragmentas (dominantis genas) įterpiamas į vektorių ir transformuojamas į šeimininko bakteriją. Tai yra pagrindinis skirtumas tarp klonavimo ir subklonavimo.
