Pagrindinis skirtumas – genų klonavimas prieš PGR
Daugelio DNR kopijų sintezė iš konkretaus DNR fragmento vadinama DNR amplifikacija. Yra du pagrindiniai DNR amplifikacijos procesai, būtent genų klonavimas ir PGR. Pagrindinis skirtumas tarp genų klonavimo ir PGR yra tas, kad genų klonavimas sukuria daugybę konkretaus geno kopijų in vivo konstruojant rekombinantinę DNR ir augant šeimininko bakterijos viduje, o PGR sukuria milijonus specifinio DNR fragmento kopijų in vitro, atliekant kartotinius denatūravimas ir sintezė.
Kas yra genų klonavimas?
Genų klonavimas yra metodas, naudojamas konkrečiam genui nustatyti ir padauginti iš išskirtos organizmo genominės DNR, sukuriant rekombinantinę DNR. Genominėje DNR yra tūkstančiai skirtingų genų, užkoduotų b altymams. Kai DNR išgaunama, ji apima visus įmanomus genus, kuriuos gali turėti. Genų klonavimo technika leido aptikti konkretų geną iš visos DNR. Todėl genų klonavimas yra svarbi priemonė molekulinėje biologijoje.
Genų klonavimo metu būtina sukurti organizmo genominę biblioteką, jei nėra jokio supratimo apie atitinkamo geno vietą DNR. Genominė biblioteka sukuriama atliekant šiuos veiksmus.
1 veiksmas: visos DNR išskyrimas iš organizmo, kuriame yra norimas genas.
2 veiksmas. Išskirtos DNR ribojamas virškinimas, kad susidarytų maži valdomi fragmentai. Šį veiksmą palengvina restrikcijos endonukleazės.
3 veiksmas: tinkamo vektoriaus parinkimas ir vektoriaus DNR atidarymas naudojant tas pačias restrikcijos endonukleazes. Bakterinės plazmidės dažniausiai naudojamos kaip vektoriai, pernešantys svetimą DNR. Plazmidės yra maži DNR apskritimai, esantys bakterijose.
4 veiksmas: vektorinės DNR ir fragmentuotos DNR sujungimas, kad susidarytų rekombinantinė DNR molekulė. Šį veiksmą valdo DNR ligazė.
5 žingsnis: Rekombinantinės DNR molekulių perkėlimas į šeimininko bakterijas. Šis veiksmas žinomas kaip transformacija ir atliekamas naudojant šilumos šoką.
5 veiksmas: transformuotų bakterijų ląstelių atranka auginimo terpėje. Transformacijos proceso pabaigoje gaunama mišri transformuotų ir netransformuotų ląstelių šeimininkų populiacija. Kadangi dominantis genas apima tik transformuotas šeimininko ląsteles. Vadinasi, būtina atrinkti transformuotas ląsteles. Atranka atliekama naudojant selektyvias terpes, kuriose yra antibiotikų. Šioje atrankos terpėje auga tik transformuotos ląstelės, todėl galima pasirinkti.
6 veiksmas: bakterijų auginimas, kad būtų sukurta genų biblioteka. Šiame etape transformuotos ląstelės šeimininkės įvedamos į šviežią auginimo terpę, kuri užtikrina optimalius augimo reikalavimus. Bendros kolonijos kultūros plokštelėse atspindi to organizmo genominę biblioteką.
7 veiksmas: rekombinantinė DNR molekulė, kurioje yra dominantis genas, turi būti patikrinta iš tūkstančių klonuotų rekombinantinės DNR fragmentų. Tai galima pasiekti naudojant zondus, kurie žymi konkretų geną arba specifinį b altymą, gautą iš to geno.
Kai suinteresuotas genas, kuriame yra bakterijų kolonija, yra identifikuojamas iš visų kolonijų, galima padaryti milijonus rekombinantinės plazmidės, kurioje yra genas, kopijų.
Genų klonavimas naudojamas kuriant genų bibliotekas, gaminant specialius b altymus, vitaminus, antibiotikus, hormonus, nustatant organizmų genomus ir kartografuojant juos, atliekant daugybę asmenų DNR kopijų kriminalistikoje ir kt.
1 pav.: Genų klonavimas
Kas yra PGR?
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra metodas, kuris sukuria daug tam tikro DNR fragmento kopijų. Eksponentinis specifinės DNR sekos amplifikacija gaunama PGR metodu in vitro sąlygomis. Šis metodas yra labai galingas molekulinės biologijos įrankis, nes jis gali padauginti nedidelį DNR mėginį į naudingą kiekį. PGR 1983 m. pristatė Kary Mullis ir šis apdovanojimą pelnęs išradimas padarė didžiulę pažangą molekulinėje biologijoje.
PGR metodika atliekama pagal pakartotines PGR reakcijas, kaip parodyta 02 paveiksle. Viena PGR reakcija susideda iš trijų pagrindinių etapų, vykstančių trimis skirtingomis temperatūromis; dvigrandinės DNR denatūravimas esant 94 °C 0C, pradmenų sujungimas 68 °0C temperatūroje ir grandinės pailgėjimas prie 72 °C 0 C. Todėl, kai atliekama PGR, norint tinkamai replikuoti, temperatūros svyravimai turi būti labai palaikomi. PGR atliekama PGR aparate, esančiame PGR mėgintuvėliuose. PGR mėgintuvėliuose yra tinkami PGR mišiniai, kuriuose yra šabloninės DNR, Taq polimerazės, pradmenų, dNTP ir buferio. Dviejų grandžių mėginio DNR denatūravimas į viengrandę DNR atliekamas suardant vandenilio ryšius tarp komplementarių bazių 94–98 0C temperatūroje. Tada pavienės šabloninės DNR grandinės yra eksponuojamos pradmenims. Turėtų būti pateikta pora pradmenų (pirmyn ir atgal), jie turi būti termostabilūs, kad toleruotų aukštą temperatūrą. Pradmenys yra vienos grandinės trumpos DNR sekos, papildančios tikslinio DNR fragmento galus. PGR naudojami sintetiniai pradmenys. Pradmenys jungiasi su papildomomis DNR mėginio bazėmis ir inicijuoja naujos grandinės sintezę. Šį žingsnį katalizuoja fermentas, vadinamas Taq polimeraze; termostabilus DNR polimerazės fermentas, išskirtas iš Thermus auqaticus. Kai yra pradmenų ir nukleotidų (statybinių blokų), Taq polimerazė sukuria naują DNR grandinę, papildančią šabloninę DNR. PGR programos pabaigoje amplifikuotas DNR fragmentas stebimas naudojant gelio elektroforezę. Jei reikia papildomos analizės, PGR produktas išvalomas iš gelio.
PGR labai naudinga diagnozuojant ir stebint genetines ir įgytas ligas, identifikuojant nusik altėlius (kriminalistikos srityje), tiriant tikslinio DNR segmento struktūrą ir funkciją, nustatant organizmų genomų seką ir kartografuojant, ir tt PGR tapo įprastine laboratorine technika medicinos ir molekulinės biologijos tyrimų laboratorijose tarp mokslininkų, nes ji naudojama labai įvairiai.
2 pav.: polimerazės grandininė reakcija
Kuo skiriasi genų klonavimas ir PGR?
Genų klonavimas prieš PGR |
|
| Genų klonavimas – tai procesas, kai per rekombinantinę DNR in vivo sukuriamos kelios konkretaus geno kopijos ir transformuojama į šeimininko bakteriją. | PGR metodas sukuria kelias tam tikros DNR sekos kopijas in vitro per pakartotinius PGR reakcijų ciklus. |
| Rekombinantinės DNR konstravimo reikalavimas | |
| Rekombinantinė DNR gaminama siekiant nustatyti geną. | Rekombinantinė DNR negaminama. |
| Darbo poreikis | |
| Šis procesas reikalauja daug darbo. | Intensyvaus darbo nereikia. |
| In vivo arba In vitro procesas | |
| Rekombinantinės DNR konstravimas vyksta in vitro, o DNR amplifikacija vyksta in vivo. | DNR amplifikacija vyksta visiškai in vitro. |
Santrauka – genų klonavimas prieš PGR
Genų klonavimas ir PGR yra du DNR amplifikacijos metodai. PGR yra in vitro procesas, kurio metu sukuriamos kelios tam tikro DNR fragmento DNR kopijos nenaudojant rekombinantinės DNR ir organizmo šeimininko. Genų klonavimas visų pirma yra in vivo procesas, kurio metu sukuriamos kelios suinteresuoto geno kopijos šeimininko organizme, sukuriant rekombinantinę DNR. Tai yra skirtumas tarp genų klonavimo ir PGR.
