Pagrindinis skirtumas – PCR pradmenys ir sekos pradmenys
Neseniai įvykus molekulinės biologijos srityje, buvo sukurti įvairūs genetiniai metodai, kurie palengvino ir tiksliai sudarė įvairių tiriamojo aspektų tyrimo procesus. PGR ir kitos sekos nustatymo procedūros yra du svarbūs tokie metodai. Jie naudoja skirtingus subkomponentus. Pradmenys laikomi pagrindine sudedamąja dalimi tiek PGR, tiek sekos nustatymo metodams. PGR pradmenys naudojami tam tikrai DNR sekai amplifikuoti, o sekos nustatymo pradmenys naudojami nustatant DNR fragmento seką, siekiant atskleisti jo specifinę nukleotidų sekos tvarką. Tai yra pagrindinis skirtumas tarp PGR pradmenų ir sekos nustatymo pradmenų.
Kas yra PGR pradmenys?
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra genetinė technika, naudojama molekulinės biologijos srityje, siekiant sustiprinti vieną ar kelias konkretaus DNR segmento kopijas ir gauti daugybę milijonų identiškų kopijų. PGR reakcijoje naudojami įvairūs komponentai, įskaitant pradmenis. Pradmenys yra trumpos DNR grandinės, kurių nukleotidų ilgis yra 18–25, todėl jie yra suderinami su amplifikuojamų DNR fragmentų pradžios ir pabaigos sritimis. Gruntai gali būti pirminis ir atvirkštinis gruntas. Šie pradmenys prisijungia prie DNR fragmento tam tikruose taškuose, kur DNR polimerazė jungiasi prie specifinio pradmens toje vietoje ir inicijuoja naujos DNR grandinės sintezę.
Pradmenų pasirinkimas yra svarbus PGR proceso aspektas. Svarbu pasirinkti grunto ilgį. Idealus ilgis būtų 18-25 nukleotidai. Jei ilgis yra per trumpas arba per ilgas, pradmenys neprisijungs prie DNR sekos, kad būtų galima tiksliai amplifikuoti. Per trumpi pradmenys sukelia nespecifinį pradmenų susijungimą skirtingose DNR sekos vietose.
01 pav.: PGR pradmenys
Guanino ir citozino (GC) kiekis gerame grunte turėtų būti 40–60. Pradmenų atkaitinimo temperatūra ir lydymosi temperatūra yra gyvybiškai svarbūs veiksniai atliekant PGR. Lydymosi temperatūra turi būti apskaičiuota tiksliai, o grunto atkaitinimo temperatūra turi būti 5 0C mažesnė už lydymosi temperatūrą. Lydymosi temperatūra turi būti 60 °C ir 75 °C. Per aukšta arba per žema temperatūra sumažins DNR polimerazės aktyvumą.
Kas yra sekos nustatymo pradmenys?
Sekvenavimo pradmenys naudojami nustatant DNR fragmento seką, siekiant atskleisti specifinę jo tapatybę. Norint gauti gerus sekos nustatymo rezultatus, svarbūs aukštos kokybės pradmenys ir šablonai. Taigi, kai pasirenkami pradmenys, jie turėtų būti unikalūs tam tikram regionui, kuriame norime sekti. Jis taip pat turėtų būti su teisinga orientacija, kur sekos paprastai generuojamos nuo 3 iki 5 colių pradmenų galų. Seka neturėtų būti nepageidaujama savaiminė hibridizacija, pvz., plaukų segtukų kilpelių susidarymas. Jame neturėtų būti iš eilės susidarančių guanino bazių.
Grunto lydymosi temperatūra (Tm) turi būti tinkama sekos sąlygoms. Todėl jis turėtų būti tarp 52oC ir 74oC. Oligonukleotidų, skirtų naudoti kaip pradmenis, paruošimas turi būti išgrynintas, kad būtų gautas norimas viso sekos ilgis. Jei oligonukleotiduose yra priemaišų, pradmenų sekos signalizacija bus perduota iš skirtingų pradmenų vietų, o tai taip pat sumažins bazinių ląstelių skaičių.
02 pav. Pradmenų sekos nustatymas
Oligonukleotido pradmenų lydymosi temperatūra (Tm) lemia, kiek stipriai komplementarios DNR grandinės yra hibridizuotos viena su kita. Tm gali būti laikomas termodinaminiu skaičiavimu, kai jis priklauso ir nuo DNR sekų, ir nuo kelių sąlygų, tokių kaip druskos koncentracija. Tm yra svarbus PGR metu, kai variantas, vadinamas ciklo sekos nustatymu, naudojamas dideoksinukleotidų baigtų fragmentų grupei gaminti. Čia sekvenuojamas pradmuo iš pradžių bus atkaitintas alternatyviai, tada pratęsiamas ir galiausiai denatūruojamas amplifikacijai. Todėl Tm vertė turėtų būti tarp 52oC ir 74o C. Susintetintus oligonukleotidus galima gauti iš DNR/RNR sintezės laboratorijų, kaip nurodyta pasirinkimas. Mažas sintezės mastas, naudojamas DNR sekos nustatymui, paprastai yra 50 nmol. Be to, svarbiausia, kad sekos nustatymui naudojami pradmenys būtų išgryninti, kad juose nebūtų priemaišų, kurios neleistų pablogėti kokybei.
Kokie yra PGR pradmenų ir sekos pradmenų panašumai?
- Ir PGR pradmenys, ir sekos nustatymo pradmenys yra pradmenys, naudojami tikslinės DNR sekos amplifikacijos procese.
- Ir PGR pradmenys, ir sekos nustatymo pradmenys sudaryti iš nukleotidų.
- Ir PGR pradmenys, ir sekos nustatymo pradmenys yra trumpi oligomerai.
Kuo skiriasi PGR pradmenys ir sekos nustatymo pradmenys?
PCR pradmenys prieš sekos pradmenis |
|
| PCR pradmenys yra trumpos DNR grandinės, kurių nukleotidų sekos ilgis yra 18–25, todėl jos yra suderinamos su amplifikuojamų DNR fragmentų pradžios ir pabaigos sritimis. | Sekvenavimo pradmenys yra trumpi oligomerai, naudojami nustatant DNR fragmento seką, siekiant atskleisti specifinę jo tapatybę. |
| Funkcija | |
| PGR pradmenys naudojami tam tikrai DNR sekai amplifikuoti. | Sekvenavimo pradmenys naudojami nustatant DNR fragmento seką, siekiant atskleisti specifinę jo tapatybę. |
| Reikalingas pradmenų skaičius | |
| Du gruntai; vienas priekinis pradmuo ir vienas atvirkštinis pradmenys naudojami kaip PGR pradmenys. | Reikia tik vieno pradmenų, kaip sekos nustatymo pradmenų. |
Santrauka – PGR pradmenys ir sekos nustatymo pradmenys
Sekvenavimo pradmenys naudojami nustatant DNR fragmento seką, siekiant atskleisti specifinę jo tapatybę. Procesui paleisti pakaks vieno sekos nustatymo grunto. Norint gauti gerus sekos nustatymo rezultatus, svarbūs aukštos kokybės pradmenys ir šablonai. Taigi, kai pasirenkami pradmenys, jie turėtų būti unikalūs tam tikram regionui, kuriame norime sekti. PGR pradmenys yra trumpos DNR grandinės, kurių nukleotidų ilgis yra 18–25, o tai suderinama su amplifikuojamų DNR fragmentų pradžios ir pabaigos sritimis. PGR pradmenys gali būti priekiniai ir atvirkštiniai pradmenys. Guanino ir citozino (GC) kiekis gerame grunte turėtų būti 40–60. Pradmenų atkaitinimo temperatūra ir lydymosi temperatūra yra gyvybiškai svarbūs PGR aspektai. Tai yra skirtumas tarp PGR pradmenų ir sekos nustatymo pradmenų.
