Pagrindinis skirtumas – nitroceliuliozė ir PVDF
Western blotting yra metodas, leidžiantis aptikti ir kiekybiškai nustatyti specifinius b altymus iš b altymų mėginio. Metodo patikimumas priklauso nuo tinkamos membranos, skirtos b altymams iš gelio absorbuoti, parinkimo. Yra įvairių tipų mikroporinių membranų. Nitroceliuliozės ir PVDF membranos yra dvi tokios membranos, kurias tyrėjai teikia pirmenybę dėl ypatingų savybių, palyginti su kitų tipų membranomis. Nitroceliuliozės arba PVDF pasirinkimas taip pat yra dar vienas iššūkis atliekant Western bloting. Tiek nitroceliuliozė, tiek PVDF pasižymi dideliu b altymų absorbcijos pajėgumu. Pagrindinis skirtumas tarp nitroceliuliozės ir PVDF membranos yra tas, kad nitroceliuliozės membranos negali pašalinti antikūnų ir pakartotinai panaudoti membraną antikūnams tirti, o PVDF membranos turi galimybę pašalinti ir pakartotinai panaudoti.
Kas yra nitroceliuliozė?
Nitroceliuliozė yra polimeras, pagamintas apdorojant celiuliozę azoto rūgštimi ir naudojamas mikroporinėms membranoms gaminti molekulinėje biologijoje, ypač naudojant blotingo metodus, tokius kaip Southern, Northern ir Western bloting. Nitroceliuliozės membranų porų dydis svyruoja nuo 3 iki 20 µm. Nitroceliuliozės mikroporinės membranos palengvina imunocheminių reakcijų, vykstančių membranos paviršiuje, aptikimą. Todėl nitroceliuliozės membranos dažnai naudojamos b altymams imobilizuoti ir specifiniams b altymams aptikti atliekant Western bloting. Nitroceliuliozės membranos taip pat gali imobilizuoti glikoproteinus ir nukleino rūgštis.
Nitroceliuliozės membranoms pirmenybė teikiama atliekant šoninio srauto tyrimus dėl kelių savybių. Nitroceliuliozės membranos sugeria didelės koncentracijos b altymus. Tirpiklis, naudojamas membranai sudrėkinti, nesumažina nitroceliuliozės membranos b altymų absorbcijos. Nitroceliuliozės membranas galima lengvai supjaustyti iki norimo gelio dydžio ir pernešti b altymus iš gelio į membraną elektriniu arba kapiliariniu būdu. Nitroceliuliozė leidžia greičiau tekėti b altymams, turintiems didelį surišimo potencialą, membraną. Nitroceliuliozė pasižymi geresne valdymo jėga. Kitas ypatingas nitroceliuliozės membranos bruožas yra tai, kad ją galima lengvai klijuoti netirpiais vandeniui atspariais klijais ant įvairių plastikinių pagrindų.
01 pav. Nitroceliuliozės membrana, skirta Western bloting'ui
Kas yra PVDF?
Polivinilideno difluoridas (PVDF) yra fluorpolimeras, gaunamas polimerizuojant vinilideno difluoridą ir pasižymi dideliu b altymų imobilizacijos gebėjimu. Todėl mikroporinės membranos, pagamintos iš PVDF, yra naudojamos Western blot metoduose, siekiant analizuoti specifinius b altymus iš b altymų mišinių. PVDF membranos taip pat gali būti naudojamos aminorūgščių analizei ir b altymų sekos nustatymui. Svarbiausia PVDF membranos, viršijančios nitroceliuliozės membraną, savybė yra ta, kad ją galima lengvai pašalinti nuo antikūnų ir pakartotinai panaudoti tolesniems antikūnų zondams.
PVDF membranos yra storesnės nei nitroceliuliozės membranos; todėl yra atsparesnis pažeidimams pakartotinio naudojimo metu. PVDF membranos yra labai hidrofobiškos. Todėl prieš naudojimą jie turi būti pamirkyti metanolyje arba izopropanolyje.
Kuo skiriasi nitroceliuliozė ir PVDF?
Nitroceliuliozė prieš PVDF |
|
| Nitroceliuliozė yra polimeras, sudarytas iš celiuliozės. | PVDF yra fluorpolimeras, gaunamas polimerizuojant vinilideno difluoridą. |
| Membranos porų dydis | |
| Tipiniai porų dydžiai yra 0,1, 0,2 arba 0,45 μ | Tipiniai porų dydžiai yra 0,1, 0,2 arba 0,45 μm |
| B altymų surišimo pajėgumas | |
| Nitroceliuliozės gebėjimas surišti b altymus yra nuo 80 iki 100 μg/cm2. | PVDF gebėjimas surišti b altymus yra 170–200 μg/cm2. |
| Jautrumas | |
| Palyginti su PVDF, jo jautrumas yra mažas. | Tai didelis jautrumas. |
| Mažai išreikštų b altymų aptikimas | |
| Kadangi nitroceliuliozės membranų jautrumas yra mažas, jis netinka mažai išreikštiems b altymams aptikti. | Dėl didelio jautrumo tai labiau tinka mažai išreikštiems b altymams aptikti. |
| Foninis triukšmas | |
| Jo foninis triukšmas mažesnis | Foninis triukšmas didesnis. |
| Sąveika su b altymais | |
| B altymų molekulės jungiasi prie nitroceliuliozės membranų per hidrofobinę sąveiką. | B altymai jungiasi prie PVDF membranų per hidrofobinę ir dipolio sąveiką. |
| Membranos prigimtis | |
| Nitroceliuliozė yra trapi ir trapi. Tačiau yra nitroceliuliozės versijų, kurios yra atsparios. | PVDF yra patvaresnis ir pasižymi didesniu cheminiu atsparumu. |
| Galimybė nuplėšti ir pakartotinai naudoti | |
| Nitroceliuliozei gali būti sunku nuimti ir permatuoti neprarandant signalo. | PVDF idealiai tinka pakartotinio zondavimo ir sekos nustatymo programoms. |
| Tinkamumas | |
| Nitroceliuliozė idealiai tinka mažos molekulinės masės b altymams aptikti. | PVDF labiau tinka didesnės molekulinės masės b altymams aptikti. |
| Kiti naudojimo būdai | |
| Nitroceliuliozė gali būti naudojama nukleino rūgščių analizei ir taškiniam/plyšiniam blotavimui. | PVDF gali būti naudojamas b altymų sekos nustatymo ir kietosios fazės tyrimų sistemoms. |
| Kaina | |
| Tai pigiau nei PVDF membranos. | Tai brangiau nei nitroceliuliozės membranos. |
| Reikia išankstinio drėkinimo | |
| Nitroceliuliozės membranų nereikia mirkyti metanoliu | PVDF membranas reikia iš anksto mirkyti metanoliu. |
Santrauka – nitroceliuliozė prieš PVDF
Nitroceliuliozės membranos buvo pirmosios komerciškai naudojamos šoninio srauto tyrimui. Jie turi didelį gebėjimą įsisavinti b altymus. Todėl Western blotinge naudojamos nitroceliuliozės membranos. PVDF yra dar vienas membranos tipas, naudojamas Western blotinge, ir jis taip pat turi didelį b altymų absorbcijos pajėgumą. Abu tipai naudojami Western blot tyrime b altymų analizei. Tačiau PVDF membranos turi daugiau ypatingų savybių, todėl jos labiau tinka Western blotavimui nei nitroceliuliozės membranos. Tačiau nitroceliuliozės membranos labiau tinka mažos molekulinės masės b altymams aptikti, PVDF membranos labiau tinka didelės molekulinės masės b altymams aptikti. Tai yra skirtumas tarp nitroceliuliozės ir PVDF membranų.
