Pagrindinis skirtumas – pasirenkamas žymeklis ir reporterio genas
Genų inžinerijos technika naudojama svarbiems genams perkelti iš organizmo į kitą organizmą. Svetimo geno įterpimas į kito organizmo genomą ir jo ekspresija šeimininko ląstelėje yra sunkiausi genų perdavimo žingsniai. Norint nustatyti transformacijos proceso sėkmę, rekombinantinėje molekulėje naudojamas atrenkamas žymeklis ir reporterio genas. Atrenkamasis žymeklis yra DNR seka arba genas, kuris ekspresuoja ir atrenka transformuotas ląsteles iš netransformuotų ląstelių. Reporterio genas yra kitas genas, naudojamas transformuotoms ląstelėms atskirti ir kiekybiškai įvertinti arba aptikti, kaip įterptas genas veikia šeimininke. Pagrindinis skirtumas tarp atrenkamo žymeklio ir reporterio geno yra tas, kad atrenkamasis žymeklis yra naudojamas netransformuotoms ląstelėms atrinkti ir signalizuoti apie transformuotas ląsteles, o reporterio genas naudojamas geno ekspresijos lygiui šeimininke nustatyti.
Kas yra pasirenkamas žymeklis?
Genų inžinerijoje dominantis genas įterpiamas į tinkamą vektorių ir transformuojamas į šeimininkus. Tačiau transformacija yra sėkminga tik kompetentingose ląstelėse-šeimininkėse, ir yra galimybė, kad ląstelės-šeimininkės atmes svetimos DNR įsisavinimą. Todėl norint tęsti tolesnius eksperimentus, svarbu diferencijuoti transformuotas ir netransformuotas ląsteles. Taigi mokslininkai į vektorių įtraukia atrenkamo žymeklio geną, kad būtų lengva atrinkti transformuotas ląsteles iš netransformuotų ląstelių. Atrenkamasis žymeklis yra DNR seka, ypač genas, naudingas identifikuojant transformuotas ląsteles. Šis žymenų genas turi savybę, kuri tinka dirbtinai transformuotų ląstelių atrankai iš netransformuotų ląstelių terpėje.
Dažniausiai molekulinėje biologijoje naudojami atrankiniai žymenys yra antibiotikams atsparūs genai. Atsparumo antibiotikams genas įterpiamas į vektorių ir transformuojamas į šeimininko ląsteles, ypač į šeimininko bakteriją. Tas konkretus antibiotikas yra įtrauktas į bakterijos auginimo terpę. Dėl selektyvaus žymeklio buvimo selektyviomis sąlygomis gali išgyventi tik ląstelės, kuriose yra atitinkamas atrenkamasis žymeklis. Netransformuotos ląstelės negali augti terpėje, kurioje yra antibiotikų. Todėl dėl pasirenkamo žymeklio, kuris yra atsparus antibiotikams, transformuotos ląstelės yra lengvai atpažįstamos.
Genai, suteikiantys antimetabolitų, herbicidų požymius, naudojami kaip selektyvūs žymenys klonuojant vektorius augalų genų inžinerijoje. Tačiau ši selektyvių žymenų kotransformacija į genetiškai modifikuotus organizmus daro neigiamą poveikį aplinkai ir žmogui. Antibiotikams atsparių bakterijų išsiskyrimas gali padidinti žmogaus patogenų atsparumą antibiotikams. Jis gali užteršti produktą arba biomasę antibiotikais ir gali prarasti selektyvų slėgį dėl antibiotikų skilimo ir inaktyvavimo.
01 pav. Plazmidinis vektorius genų perkėlimui su pasirenkamu žymekliu
Kas yra reporterio genas?
Reporteriniai genai yra genai, leidžiantys aptikti arba išmatuoti įterpto geno ekspresiją. Šie reporteriniai genai gali būti prijungti prie dominančio geno reguliavimo sekų, kad būtų pranešta apie ekspresijos vietą arba lygius. Todėl, ekspresuojant genus pagal tą patį promotorių, jie transkribuojami į vieną mRNR seką, o po to paverčiami b altymu, kuris gali rodyti genų ekspresijos lygį.
Reporterių genai yra įvairių tipų ir turi vizualiai identifikuojamų savybių, kurios paprastai yra susijusios su fluorescenciniais ir liuminescenciniais b altymais. Genai, koduojantys fluorescencinius b altymus ir fermentus, nematomus substratus paverčiantys liuminescenciniais arba spalvotais produktais, pranešdami apie sėkmingą genų ekspresiją ir suteikdami galimybę kiekybiškai įvertinti genų ekspresiją.
02 paveikslas: Reporterio geno ekspresija
Kuo skiriasi Selectable Marker ir Reporter Gene?
Pasirinkiamas žymeklis prieš reporterio geną |
|
| Pasirinkiamas žymeklis yra tam tikra DNR seka, padedanti atskirti transformuotas ląsteles nuo netransformuotų ląstelių. | Reporterio genas yra genas, padedantis kiekybiškai įvertinti norimo geno, įterpto į šeimininko ląstelę, ekspresiją. |
| Pagamintų vienetų pobūdis | |
| Genai yra užkoduoti savybėmis, kurios padeda dirbtinai atrankai auginimo terpėje. | Genai yra užkoduoti vizualiai identifikuojamomis savybėmis. |
| Naudojimas | |
| Atsparumo antibiotikams genai, antimetabolitų genai, atsparumo herbicidams genai ir kt. yra pasirenkamų žymenų pavyzdžiai. | Genai koduoja žalią fluorescencinį b altymą, β-gliukuronidazę, chloramfenikolio acetiltransferazę, raudoną fluorescencinį b altymą ir kt. yra pavyzdžiai. |
Santrauka – pasirenkamas žymeklis prieš reporterio geną
Pasirinkti žymekliai leidžia transformuotoms ląstelėms augti selektyvioje terpėje, kurioje dozuojamas tam tikras antibiotikas arba herbicidas. Jie naudojami ankstyvai transformuotų ląstelių atrankai. Reporteriniai genai naudojami kiekybiškai įvertinti norimo įterpto geno ekspresijos lygį. Jie taip pat leidžia diferencijuoti transformuotas ir netransformuotas ląsteles. Tai yra skirtumas tarp atrenkamo žymeklio ir reporterio geno. Atrenkamasis žymeklis ir reporterio genai yra laikomi svarbiais žymenimis genų inžinerijoje.
