Pagrindinis skirtumas – DNR ir RNR ekstrahavimas
DNR ir RNR tyrimas yra gyvybiškai svarbūs aspektai, siekiant suprasti pagrindines molekulinės biologijos, biotechnologijų ir genetikos sąvokas. Norint atlikti eksperimentines procedūras šių tyrimų metu, būtina išgauti gryną DNR ir RNR mėginius. Pagrindinis skirtumas tarp DNR ir RNR ekstrahavimo yra tas, kad DNR ekstrahavimo procesas išvalo DNR, o RNR ekstrahavimas - RNR. DNR ekstrahavimo procesą sudaro trys skirtingi etapai: ląstelių lizė ir membraninių lipidų bei b altymų katabolizmas, katabolitų sulipimas koncentruotu druskos tirpalu ir DNR nusodinimas etanoliu. Trijų etapų procedūra gali būti sudaryta iš dviejų pasirenkamų žingsnių. RNR gryninimo procesą sudaro keturi skirtingi etapai: guanidžio tiocianato pridėjimas ląstelių lizei, b altymų denatūravimas, įskaitant ribonukleazes, RNR atskyrimas pridedant chloroformo ir fenolio ir nuosėdų plovimas etanoliu.
Kas yra DNR ekstrahavimas?
DNR ekstrahavimas yra fizinis ir cheminis procesas, naudojamas DNR iš mėginio išgryninti. DNR išskyrimas yra svarbus aspektas molekulinės biologijos ir teismo medicinos srityse. Procesą sudaro trys pagrindiniai etapai. Iš pradžių reikia gauti dominančias ląsteles. Tada palengvinama ląstelių lizė, siekiant suardyti ląstelės membraną, kuri atveria ląstelę ir atskleidžia citoplazmą kartu su DNR. Paviršinio aktyvumo medžiagos arba kiti plovikliai gali būti naudojami lipidams iš ląstelės membranos lizuoti, o esančius b altymus katabolizuoja proteazės. Tai neprivalomas veiksmas. Kai ląstelė lizuojama, koncentruoti druskos tirpalai palengvina katabolizuotų molekulių sulipimą. Po to centrifuguojamas tirpalas, kuris atskiria nuolaužų gumulėlius nuo DNR. Šiame etape diferencijuota DNR sumaišoma su reagentais ir druskomis, naudojamais ląstelių ciklo metu.
01 pav.: DNR išskyrimas
Norint toliau jį išvalyti, galima atlikti šiuos veiksmus. Vienas iš būdų yra nusodinimas etanoliu, kurio metu ledinis etanolis sumaišomas su atskirtu DNR mėginiu. DNR netirpsta alkoholyje ir dėl to susidaro nuosėdos dėl DNR molekulių agregacijos. Šiame procese pridedamas natrio acetatas, siekiant padidinti kritulių laipsnį, padidinant jonų stiprumą. Be etanolio nusodinimo proceso, taip pat gali būti sukeltas fenolio-chloroformo ekstrahavimo procesas. Šiuo metodu fenolis denatūruoja mėginyje esančius b altymus. Centrifugavus, denatūruoti b altymai liks organinėje fazėje, o DNR molekulės, sumaišytos su chloroformu, bus vandeninėje fazėje. Chloroformas pašalins fenolio likučius. Baigus ekstrahuoti, DNR laikoma ištirpinta TE buferyje arba itin gryname vandenyje.
Kas yra RNR ekstrahavimas?
RNR gryninimas yra procesas, kurio metu RNR išvaloma iš biologinio mėginio. Dėl ribonukleazės buvimo ląstelėse ir audiniuose šis procesas yra sudėtingas. Ribonukleazės fermentas turi savybę greitai skaidyti RNR. Ribonukleazių cheminė prigimtis yra labai stabili, todėl jas sunku inaktyvuoti. Galimas pasirinkimas neutralizuoti ribonukleazes. Kadangi šis fermentas yra visur ląstelėse ir audiniuose, RNR ekstrahavimui yra sukurti specialūs metodai. Iš daugelio metodų dažniausiai naudojamas guanidinio tiocinato-fenolio-chloroformo ekstrahavimas.
02 pav.: RNR ekstrahavimas
Guanidinio tiocinato-fenolio-chloroformo ekstrahavimo metodas priklauso nuo centrifugavimo ir fazių atskyrimo. Centrifuguotinas mišinys susideda iš vandeninio mėginio ir vandeniu prisotinto tirpalo, kurį sudaro fenolis ir chloroformas. Centrifuguotas tirpalas susideda iš viršutinės vandeninės fazės ir apatinės organinės fazės neutraliomis pH sąlygomis (pH 7-8). RNR yra vandeninėje fazėje. Organinę fazę paprastai sudaro b altymai, ištirpinti fenolyje, ir lipidai, ištirpinti chloroforme. Pridedama chaotropinė medžiaga (molekulė, galinti nutraukti vandenilio ryšius tarp vandens molekulių); tai žinoma kaip guanidinio tiocianatas. Šis agentas turi galimybę denatūruoti b altymus, įskaitant ribonukleazes, kurios gali skaidyti RNR ir dalyvauja ląstelių lizėje. Jis taip pat atskiria rRNR nuo ribosomų b altymų. Paskutinis RNR gryninimo etapas yra vandeninės fazės nuosėdų plovimas etanoliu. RNR taip pat galima išvalyti naudojant skystą azotą.
Kokie yra DNR ir RNR ekstrahavimo panašumai?
- Abu ekstrahavimo procesai naudoja kenksmingas chemines medžiagas, tokias kaip fenolis ir chloroformas.
- Centrifugavimas yra esminis abiejų procesų metodas.
- Etanolis naudojamas nuosėdoms plauti ir išgrynintai DNR arba RNR gauti.
Kuo skiriasi DNR ir RNR ekstrahavimas?
DNR prieš RNR ekstrahavimą |
|
| DNR ekstrahavimas yra procesas, kurio metu iš organizmo arba mėginio išskiriama DNR. | RNR ekstrahavimas yra procesas, kurio metu RNR išgaunama iš mėginio. |
| Žingsniai | |
| DNR ekstrahavimo procesas susideda iš trijų skirtingų etapų su dviem pasirenkamais etapais. | RNR ekstrahavimo procesas susideda iš keturių skirtingų etapų. |
| Reagentai | |
| DNR ekstrahavimui naudojamos paviršinio aktyvumo medžiagos, proteazės (nebūtina), alkoholis, chloroformas, fenolis, natrio acetatas. | RNR ekstrahavimui naudojamas guanidžio tiocianatas, chloroformas, fenolis, etanolis. |
Santrauka – DNR ir RNR ekstrahavimas
DNR ir RNR ekstrahavimas yra gyvybiškai svarbūs eksperimentinių procedūrų aspektai tiriant molekulinę biologiją, genetiką ir biotechnologijas. Abiejuose procesuose naudojami panašūs reagentai, tačiau RNR ekstrahavimui naudojamas specialus reagentas, žinomas kaip guanidžio tiocianatas, kuris sumažina ribonukleazių aktyvumą. Tai yra pagrindinis skirtumas tarp DNR ir RNR ekstrahavimo.
Atsisiųskite DNR ir RNR išskyrimo PDF versiją
Galite atsisiųsti šio straipsnio PDF versiją ir naudoti ją neprisijungus, kaip nurodyta citatos pastaboje. Atsisiųskite PDF versiją čia. Skirtumas tarp DNR ir RNR ekstrahavimo
