Pagrindinis skirtumas – RT PCR vs QPCR
Polimerazės grandininė reakcija yra metodas, naudojamas amplifikuoti tam tikrą DNR sritį in vitro. 1983 m. Kary Mullis išrado šią techniką, todėl mokslininkai gali padaryti nuo tūkstančių iki milijonų specifinių DNR fragmentų kopijų tyrimų tikslais. Šiuo metu tai tapo įprasta ir įprastai atliekama metodika klinikinėse ir mokslinių tyrimų laboratorijose, pritaikyta įvairiems tikslams. Yra įvairių tradicinių PGR metodų, tokių kaip RT PGR, įdėtoji PGR, multipleksinė PGR, Q PGR, RT – QPGR ir kt. RT PGR ir Q PGR yra du svarbūs PGR variantai. Pagrindinis skirtumas tarp RT PGR ir Q PGR yra tas, kad RT PGR naudojamas genų ekspresijai aptikti sukuriant komplementarius DNR (cDNR) nuorašus iš RNR, o Q PCR naudojamas kiekybiškai išmatuoti PGR produktus realiuoju laiku, naudojant fluorescencinius dažus.
Kas yra RT PGR?
Atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (RT PGR) yra PGR variantas, naudojamas RNR ekspresijai nustatyti. Tai labai svarbus metodas mRNR ekspresijai audiniuose nustatyti. RT PGR naudojama, kai pradinė mėginio medžiaga yra RNR. RT PGR metu šabloninė mRNR pirmiausia paverčiama komplementaria DNR. Šį žingsnį katalizuoja fermentas atvirkštinė transkriptazė, o procesas žinomas kaip atvirkštinė transkripcija. Antra, naujai susintetintai cDNR amplifikacijai naudojamas tradicinis PGR.
RT PGR yra labai jautrus metodas, kuriam reikalingas palyginti nedidelis RNR mėginio kiekis. RT PGR dažniausiai naudojamas diagnozuojant ir kiekybiškai nustatant RNR rūšis, ypač RNR virusus, tokius kaip žmogaus imunodeficito virusas ir hepatito C virusas.
01 pav.: RT PGR technika
Kas yra QPCR?
Kiekybinė PGR (QPCR) yra PGR variantas, naudojamas kiekybiškai išmatuoti PGR produktus. Jis taip pat vadinamas realaus laiko polimerazės grandinine reakcija, nes matuoja realiojo laiko amplifikaciją naudojant realaus laiko PGR aparatą. Tai tinkamas būdas nustatyti mėginyje esančios tikslinės sekos arba geno kiekį. Įdomi QPCR savybė yra ta, kad ji sujungia tiek stiprinimą, tiek tikrąjį kiekybinį nustatymą į vieną veiksmą. Todėl aptikimo gelio elektroforezės poreikį galima pašalinti naudojant QPCR metodą. QPCR naudoja fluorescencinius dažus, kad ženklintų PGR produktus PGR reakcijų metu, kurios galiausiai lemia tiesioginį kiekybinį įvertinimą. Kai kaupiasi PGR produktai, kaupiami ir fluorescenciniai signalai, kuriuos matuoja realaus laiko mašina. QPCR galima derinti su RT PGR. Jis žinomas kaip RT – QPCR arba QRT – PGR ir yra laikomas galingiausiu, jautriausiu ir kiekybiniu būdu nustatant RNR lygį ląstelėse ar audiniuose.
SYBR Green ir Taqman yra du metodai, naudojami realaus laiko PGR amplifikacijos procesui aptikti arba stebėti. SYBR Green metodas atliekamas naudojant fluorescencinį dažą, vadinamą SYBR green, ir aptinka amplifikaciją, surišdamas dažus, kad susidarytų dvigrandė DNR. Taqman atliekama naudojant dvigubai paženklintus zondus ir aptinka amplifikaciją zondui skaidant Taq polimeraze ir fluoroforo išsiskyrimą, kaip parodyta 02 paveiksle. Abu metodai stebi amplifikacijos proceso eigą ir praneša apie produkto kiekį realiu laiku..
Realiojo laiko PGR pritaikymas labai įvairus, pavyzdžiui, genų ekspresijos kiekybinis nustatymas, mikroRNR ir nekoduojančios RNR analizė, SNP genotipų nustatymas, kopijų skaičiaus variantų aptikimas, retų mutacijų aptikimas, genetiškai modifikuotų organizmų aptikimas, infekcinių agentų aptikimas. ir tt
02 pav.: Kiekybinė PGR technika
Kuo skiriasi RT PGR ir QPCR?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PGR yra metodas, naudojamas aptikti genų ekspresiją amplifikacijos būdu. | QPCR yra technika, kuri amplifikuoja DNR ir kiekybiškai įvertina PGR produktus realiuoju laiku. |
| Atvirkštinės transkriptazės fermento dalyvavimas | |
| RT PGR naudojama fermento atvirkštinė transkriptazė. | Fermentų atvirkštinė transkriptazė QPGR nenaudojama. |
| Fluorescenciniu būdu pažymėtų molekulių naudojimas | |
| Fluorescenciniu būdu pažymėti dažai arba zondai nenaudojami RT PGR. | QPCR naudojami fluorescenciniu būdu pažymėti dažai arba zondai. |
| PGR produkto kiekybinis nustatymas | |
| Nebent kartu su QPCR, RT PGR nenustato PGR produkto kiekio. | QPCR kiekybiškai išmatuokite PGR produktą. |
| Pradžios medžiaga | |
| Pradinė medžiaga yra mRNR. | Pradinė medžiaga yra DNR. |
| CDNR sintezė | |
| Atliekant RT PGR susidaro papildoma DNR. | Atliekant QPGR, papildoma DNR negaminama. |
Santrauka – RT PCR vs QPCR
RT PGR ir QPCR yra dvi tradicinės PGR versijos. RT PGR technika atliekama mRNR mėginiams ir ją skatina atvirkštinė transkripcija ir cDNR gamyba. QPCR naudojamas PGR produktų kiekybiniam įvertinimui realiuoju laiku PGR terminių ciklų metu naudojant fluorescencinius dažus arba paženklintus zondus. Atliekant QPCR, PGR produkto kiekis parodomas mėginio skleidžiamais fluorescenciniais signalais. RT PGR populiariai naudojamas kaip amplifikacijos procesas, o QPCR dažniausiai naudojamas kaip kiekybinio nustatymo procesas. Tai yra skirtumas tarp RT PGR ir QPCR.
