Pagrindinis skirtumas – Microarray vs RNR sekos nustatymas
Transkriptas reiškia visą ląstelėje esantį RNR, įskaitant mRNR, rRNR, tRNR, suskaidytą RNR ir nesuskaidytą RNR. Transkripto profiliavimas yra svarbus procesas norint suprasti ląstelių įžvalgas. Yra keli pažangūs transkripto profiliavimo metodai. Microarray ir RNR sekos nustatymas yra dviejų tipų technologijos, sukurtos transkripto analizei. Pagrindinis skirtumas tarp mikrogardelių ir RNR sekos nustatymo yra tas, kad mikrogardelė yra pagrįsta iš anksto suprojektuotų žymėtų zondų hibridizacijos potencialu su tikslinėmis cDNR sekomis, o RNR sekos nustatymas yra pagrįstas tiesioginiu cDNR grandžių sekos nustatymu naudojant pažangius sekos nustatymo metodus, tokius kaip NGS.„Microarray“atliekama turint išankstinių žinių apie sekas, o RNR sekos nustatymas atliekamas be išankstinių žinių apie sekas.
Kas yra „Microarray“?
Microarray yra tvirtas, patikimas ir didelio našumo metodas, kurį mokslininkai naudoja transkripto profiliavimui. Tai populiariausias nuorašo analizės metodas. Tai nebrangus metodas, kuris priklauso nuo hibridizacijos zondų.
Metodas prasideda mRNR ekstrahavimu iš mėginio ir cDNR bibliotekos konstravimu iš visos RNR. Tada jis sumaišomas su fluorescenciniu būdu pažymėtais iš anksto suprojektuotais zondais ant kieto paviršiaus (taškinės matricos). Komplementarios sekos hibridizuojasi su pažymėtais zondais mikrogardelyje. Tada mikromasyvas nuplaunamas ir patikrinamas, o vaizdas kiekybiškai įvertinamas. Surinktus duomenis reikia išanalizuoti, kad būtų gauti santykiniai išraiškos profiliai.
Manoma, kad mikromatricos zondų intensyvumas yra proporcingas mėginio nuorašų kiekiui. Tačiau technikos tikslumas priklauso nuo suprojektuotų zondų, išankstinių žinių apie seką ir zondų afiniteto hibridizacijai. Taigi „microarray“technologija turi apribojimų. „Microarray“technikos negalima atlikti naudojant mažo gausumo transkriptus. Jis nesugeba atskirti izoformų ir nustatyti genetinių variantų. Kadangi šis metodas priklauso nuo zondų hibridizacijos, kai kurios su hibridizacija susijusios problemos, pvz., kryžminė hibridizacija, nespecifinė hibridizacija ir kt., kyla naudojant mikrogardelių techniką.
01 pav.: mikromasyvas
Kas yra RNR sekos nustatymas?
RNR šautuvų sekos nustatymas (RNA seka) yra neseniai sukurta visos transkripto sekos nustatymo technika. Tai greitas ir didelio našumo transkripto profiliavimo metodas. Tai tiesiogiai kiekybiškai įvertina genų ekspresiją ir lemia gilų transkripto tyrimą. RNR seka nepriklauso nuo iš anksto sukurtų zondų ar išankstinių žinių apie sekas. Todėl RNR seq metodas yra labai jautrus ir gali aptikti naujus genus ir genetinius variantus.
RNR sekos nustatymo metodas atliekamas keliais etapais. Bendra ląstelės RNR turi būti izoliuota ir suskaidyta. Tada, naudojant atvirkštinę transkriptazę, reikia paruošti cDNR biblioteką. Kiekviena cDNR grandinė turi būti susieta su adapteriais. Tada surišti fragmentai turi būti amplifikuoti ir išvalyti. Galiausiai, naudojant NGS metodą, turi būti atlikta cDNR seka.
02 pav.: RNR sekos nustatymas
Kuo skiriasi Microarray ir RNR sekos nustatymas?
Microarray vs RNR sekos nustatymas |
|
| Microarray yra tvirtas, patikimas, didelio našumo metodas. | RNR sekos nustatymas yra tikslus ir didelio našumo metodas. |
| Kaina | |
| Tai nebrangus metodas. | Tai brangus metodas. |
| Didelio mėginių skaičiaus analizė | |
| Tai palengvina daugelio mėginių analizę vienu metu. | Tai palengvina daugelio mėginių analizę. |
| Duomenų analizė | |
| Duomenų analizė sudėtinga. | Šiuo metodu sugeneruojama daugiau duomenų; todėl procesas yra sudėtingesnis. |
| Išankstinės žinios apie sekas | |
| Šis metodas pagrįstas hibridizacijos zondais, todėl reikia išankstinių žinių apie sekas. | Šis metodas nepriklauso nuo išankstinių žinių apie seką. |
| Struktūriniai variantai ir nauji genai | |
| Šis metodas negali aptikti struktūrinių variacijų ir naujų genų. | Šis metodas gali aptikti struktūrinius pokyčius, pvz., genų susiliejimą, alternatyvų susiliejimą ir naujus genus. |
| Jautrumas | |
| Tai negali aptikti izoformų išraiškos skirtumų, todėl jo jautrumas yra ribotas. | Tai didelis jautrumas. |
| Rezultatas | |
| Tai gali sukelti tik santykinius išraiškos lygius. Tai nesuteikia absoliutaus geno ekspresijos kiekybinio įvertinimo. | Jis suteikia absoliutų ir santykinį išraiškos lygius. |
| Duomenų pakartotinė analizė | |
| Tai reikia paleisti iš naujo, kad būtų galima iš naujo išanalizuoti. | Sekos duomenis galima analizuoti iš naujo. |
| Reikalingas konkretus personalas ir infrastruktūra | |
| Norint naudoti mikromasyvą, nereikia specialios infrastruktūros ir personalo. | RNR sekos nustatymui reikalinga specifinė infrastruktūra ir personalas. |
| Techninės problemos | |
| „Microarray“technologija turi techninių problemų, pvz., kryžminė hibridizacija, nespecifinė hibridizacija, ribotas atskirų zondų aptikimo dažnis ir kt. | RNR seq technika leidžia išvengti techninių problemų, tokių kaip kryžminė hibridizacija, nespecifinė hibridizacija, ribotas atskirų zondų aptikimo dažnis ir kt. |
| Pašalinimai | |
| Tai šališkas metodas, nes jis priklauso nuo hibridizacijos. | Pokrypis yra mažas, palyginti su mikromasyvu. |
Santrauka – Microarray vs RNR sekos nustatymas
Microarray ir RNR sekos nustatymo metodai yra didelio našumo platformos, sukurtos transkripto profiliavimui. Abu metodai duoda rezultatus, kurie labai koreliuoja su genų ekspresijos profiliais. Tačiau genų ekspresijos analizei RNR sekos nustatymas turi pranašumų, palyginti su mikromatrica. RNR sekos nustatymas yra jautresnis metodas mažo gausumo nuorašams aptikti nei mikro matrica. RNR sekos nustatymas taip pat leidžia atskirti izoformas ir identifikuoti genų variantus. Tačiau „microarray“yra įprastas daugelio tyrinėtojų pasirinkimas, nes RNR sekos nustatymas yra naujas ir brangus metodas, turintis duomenų saugojimo iššūkius ir sudėtingą duomenų analizę.
